血筛核酸实验室污染预防及发生后的应对措施策略.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,SZBC,为何要,高度重视核酸实验室,环境污染并制订应对策略,核 酸 检 测 技 术,（,nucleic acid amplification testing,NAT,）包括两种扩增方式：,1.,聚合酶链锁反应法,（,Polymerase chain reaction,，,PCR),2.,转录介导的扩增方法,(transcription mediated amplification,TMA),核 酸 检 测 技 术,目前核酸检测（,NAT,）已经在输血安全血液筛查方面发挥着越来越大的作用。但是由于其敏感性极高微量的污染将造成实验失败.,核酸检测污染可能产生假阳性结果,行政主管部门颁布文件,临床基因扩增实验室管理暂行办法,医疗机构临床扩增实验室管理办法,血站核酸检测实验室质量保证指南,血站核酸检测,(NAT),实验室是具有特殊安全要求的工作场所,极微量的污染即可导致假阳性结果,保障血液安全（输血安全）,保护献血资源（献血安全）,1,2,3,4,影响核酸实验室污染因素,核酸实验室污染的判断和预防,核酸实验室污染的消除,核酸实验室污染的监控及对策,报告内容,一、影响,NAT,实验室污染因素,影响,NAT,实验室污染因素,一,核酸实验室,设备污染,标本阳性率异常增高,阴性对照出现阳性,其 他 污 染,产 物 污 染,试 剂 污 染,标 本 污 染,核酸实验室污染,原因,一,标本容器被污染,标本放置时,由于密封不严溢于容器外,标本核酸模板在提取过程中，由于操作导致标本间污染,在进行标本处理时，病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染,标本污染,试剂污染,试剂处理配制过程中,移液器,容器,实验用水,或储存不当,核酸实验室污染,原因,一,产物污染,-,最主要最常见,极微量的扩增产物污染,就可形成假阳性。,（产物来源可能来源于设备内部，或实验室外部实验活动产生的污染）。,产物污染,其他污染,实验室中克隆质粒的污染,分子生物学实验室及用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见,克隆质粒在单位容积内含量浓度高,其污染可能性也很大,独立的通风,系统,二、核酸实验室污染的判断和预防,核酸实验室污染,的判断和预防,二,密切观察实验室每天检测的阳性情况,及时评估鉴别实验数据与初筛数据的变化情况,核酸实验室污染,的判断和预防,二,阳性标本数量异常增高,渐进式,(,假阳性日益增多）,散发式（假阳性样品不定期增多）,突发式,(,假阳性样品突然增多,),阴性对照出现阳性反应,实验室污染的表现形式,核酸实验室污染,的判断和预防,二,定期统计实验室阳性数量,核酸实验室污染,的判断和预防,二,可能存在的污染情况,试剂污染,(,更换新的试剂重新检测评估,),标本污染,(,重新采样进行检测,评估标本前处理环节,),设备污染,(,设备整体消毒清洁,维护,),产物污染（全面清洁消毒实验室、仪器设备所有实验有关用品）,针对可能发生的污染情况有的放矢,核酸实验室污染,的判断和预防,二,合理的核酸实验室分区,合格的实验操作人员,合适的检测试剂和检测平台,严谨、科学的质量管理体系,完善的实验室环境监控措施,完备的实验室配套设施,血筛核酸实验室仪器设备特点：,高自动化,高检测通量,高信息化,提供良好条件预防实验室的污染,严格的管理,-,可操作性的,SOP,严格控制进出实验室的人员。严格执行,核酸实验室设置与管理规范,的管理；,尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性；,核酸实验室医疗废物按,医疗废物管理程序,执行。废液不能在实验室中倾倒。,扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质，应特别注意实验人员的安全防护。,反应在同一管中进行,加入油密闭的反应体系,扩增产物RNA易于灭活,核酸检测系统的防污染设计,封闭的实验环境,方便快捷的试剂装载,试剂分配区、样本分配区相互隔离,扩增反应管的密封性能,实验废弃物收集区相对隔离,6,样本混合,PCR,检测方法,核酸提取和扩增检测,:,三重防污染设计,仪器封闭,反应管封闭,避免交叉污染,;,UNG,酶,;,即用型试剂无需配制,什么是“,UMG,酶”,uracil-N-glycosylase,尿嘧啶,-N-,糖基化酶,(UNG),酶,UNG,酶的作用原理：,是选择性水解断裂含有,dU,的双链或单链,DNA,中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的,DNA,链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。,作用：,为保证,PCR,结果的准确性，,预防非特异性,PCR,扩增和污染,。常用的措施是使用,UNG,酶,(Uracil-N-Glycosylase),和,Taq,酶热启动。,PCR,反应最常见,最重要的污染物是,PCR,产物,防污染热启动,PCR,试剂盒以,dUTP,取代,dTTP,，所以,PCR,产物都是含有,dU,的,DNA,链。在,PCR,开始前增加,50,的保温步骤，,UNG,酶,即可将反应体系中已有的,U-DNA,污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下,DNA,链断裂,消除由于污染,DNA,产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。,即开即用型试剂,全部试剂采用“,即,开即,用型,”包装,完全无须人工配制,避免人工操作可能带来的失误,.,唯一可实现所有试剂,2-8,度保存,无须冷冻冰箱,复温,方便运输和实验室质量管理,.,样本管上机检测是均是闭管状态，有效避免样品间的交叉污染,严格执行核酸检测工作要求,克服血清学检测的工作习惯,细致的工作流程,正确的上样方式。,正确的试剂装载方式,正确的仪器设备维护方式,正确的医疗废物处理方式,规范的预防措施,严格的管理,-,制定可操作性的,SOP,严格控制进出实验室的人员。严格执行,核酸实验室设置与管理规范,的管理；,尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性；,核酸实验室医疗废物按,医疗废物管理程序,执行。废液不能在实验室中倾倒。,扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质，应特别注意实验人员的安全防护。,离心后的标本应垂直放置；,标准品和指控品开盖前垫一次性纸巾；,上样时不碰到试管口；,试管不可从开盖标本上方经过；,注意上样的顺序，先放置样本，再放标准品、质控品；,及时更换可能污染的手套，不可反复使用一次性手套,完成加样后标本、标准品、质控品应及时加盖；,丢弃试剂前应该加盖拧紧；,应及时封闭污物袋；,将样品和标准品对照品去掉盖子，按照工作列表插入样品架避免交叉污染；,实验中须使用一次性手套，手套在实验过程中疑有污染应立即更换，每个区的物品均有明确标示，各室物品不得混用。,避免因不能戴上手套而用手反复搓揉手套或用口吹胀手套的行为；,实验人员经过全国血液病毒核酸检测培训班培训并取得上岗证；,每天清洁一遍工作台面，每月彻底维护清洁一遍检测系统（包括分析设备，电脑，辅助设备等）；,规范的预防措施,核酸实验室污染,的判断和预防,二,预防为主，严守规程,三、核酸实验室污染的消除,查找可疑污染源,1),回顾检查试剂的存放和使用过程,2),设备有无存在污染物外泄。,3),排查是否为扩增产物污染,4,）评估标本是否处理不当,5),环境是否受到外来性的污染。,1,）更换新的试剂,2,）到其他核酸实验室验证试剂是否污染,3,）更换核酸实验室所有耗材：记号笔，记录本，甚至拖把等等,1,）实验台面、超净工作台用现配的,3%,双氧水或次氯酸钠溶液擦拭清洁,2,）用,10%,漂白粉溶液擦拭,3,）紫外光照射，照射距离应不超过,90 cm,，照射时间最好过夜,4,）通风,更换试剂、耗材,清洁所有可能污染源,核酸实验室污染,的消除,三,研究证明，紫外线照射、,84,消毒液是清除实验室外源性,DNA,污染的,有效方法；台面、地面消毒推荐过氧乙酸消毒液、次氯酸钠溶液和,戊二醛消毒液,。,经过空气下落法取样追踪实验，结果是阳性，推断污染可能是由空气中,PCR,产物的气溶胶造成的。若所有处理后连续三次仍为阳性,更换实验场所,核酸检测,1),空气下落法取样,在每个取样点放置,3,个样品管，每管,4ml,生理盐水暴露放置,1 h,后，,进行核酸检测,2),物体表面擦拭法取样,用,5cm5cm,标准涂擦法，用浸有生理盐水的棉拭子按照上述标准横竖,往返均匀涂擦,5,次，并随之转动棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子,放入无菌的,4 ml,生理盐水试管内浸泡,30min,后弃棉拭子，对棉拭子,浸泡液进行核酸检测,标本污染实验室台面后，用纸巾初步清洁台面，然后用,84,消毒原液清洗，用去离子水清洁。,使用,75%,的酒精清洁污染处。停止使用被污染的工作台，按,可移动紫外线灯标准操作规程,进行紫外消毒,。,每天,0.5,84,消毒液清洁地面。,标本污染的紧急处理,清洁实验室墙面、地面、工作台面。,对空气用紫外灯进行消毒,清理工作台面多余的物品（如文件盒、文具、各种与实验无关的物品）。,检查更换空调滤网、对空调、天花板进行清洁消毒。,检查各实验室间的空气流通是否独立。,定期（每周一次）消毒离心机、离心杯、上样试管架。,实验室环境污染的处理,污染清除后的确认,对一定数量的个阴性标本或盐水（,90,个）进行检测，结果均为阴性,随时观察后续实验的阳性情况,四、核酸实验室污染,的监控及对策,核酸实验室污染,的监控及对策,四,对照质控成功,可重复性,血液筛查核酸实验室,每月,要对,暴露表面有无核酸扩增产物污染的,发生进行,监测,设备表面,工作台面,辅助设备（手推车、试剂摇摆移等）,试管架的浸泡消毒,好的核酸实验室，要时刻注意污染的监测并制订有 效的防范机制,有无污染？,什么原因造成的污染？,采取什么措施，防止和消除污染？,实验室污染的监控,设立阴、阳性对照，即可验证核酸检测的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性,选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品,如果扩增结果中阴性对照为阳性反应，就是某一种或数种试剂被污染了，此时要全部更换一批新的试剂进行扩增。,设立阴阳性对照,定期监控室内环境,空气下落法取样,物体表面擦拭法取样,对容易造成污染的工作面进行定期监控，建议1次/月,门把手,离心机摆放台面,离心机开盖处,样本处理区试剂,试剂操作工作台,报告发放区,定期对仪器设备的运行环境进行监控,清洁设备表面,对仪器设备的辅助用品定期消毒,定期清洁消毒离心机、离心杯,试管架,污染的监测,一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。,定期检查紫外灯管的消毒是否有效？,一般国际上通行的标准使用时间，低功率密度的灯管，功率密度为,4080W/cm,，使用寿命为,1000h,2000h,。,采集时间,采集人,环境采样检测信息,检测时间,检测人,序号,采集位置,检测结果（,NAT,）,1,核酸,I,室门把手,阴性,/,阳性,/1/3,，,2/3,，,3/3,/,2,核酸,I,室,(RPI),设备,I,台面,阴性,/,阳性,/1/3,，,2/3,，,3/3,/,3,核酸室,(RPI),设备台面,阴性,/,阳性,/1/3,，,2/3,，,3/3,/,4,核酸室离心机摆放台面,阴性,/,阳性,/1/3,，,2/3,，,3/3,/,5,核酸室工作台面,I,阴性,/,阳性,/1/3,，,2/3,，,3/3,/,6,核酸室工作台面,阴性,/,阳性,/1/3,，,2/3,，,3/3,/,7,核酸检测室,(,室,),报告发放区,阴性,/,阳性,/1/3,，,2/3,，,3/3,/,8,核酸检测室,(,室,),工作台面,I,阴性,/,阳性,/1/3,，,2/3,，,3/3,/,9,核酸检测室,(,室,),工作台面,阴性,/,阳性,/1/3,，,2/3,，,3/3,/,10,1363Tigris,样品放置区把手,阴性,/,阳性,/1/3,，,2/3,，,3/3,/,11,1631Tigris,样品放置区把手,阴性,/,阳性,/1/3,，,2/3,，,3/3,/,12,盐水对照管,阴性,/,阳性,/1/3,，,2/3,，,3/3,/,监控结果：,科主任：,日期：,核酸实验室环境监控记录表,备注：取样方法,1,、取干净真空分离胶采血管，装入新开瓶的,5ml,生理盐水并将其编上“序号”。,2,、取干净棉签在相应位置擦拭取样后放入装有生理盐水的试管内，放置,5,分钟,室内质量控制在使用试剂方面要做到,4,个必须,1,）,必须,保证使用试剂中有内标的存在,;,2,）,必须,保证试剂存放符合要求，防止污染导致假阳性的出现,;,3,）,必须,采用阴性对照，以判断核酸实验室是否遭受污染,4,）,必须,每个检测批次都应有阳性对照，且阳性对照的浓度不宜过高，约为仪器检测下限,3-5,倍左右，以监测核酸提取的有效性,5,）,卫生部临床检验中心组织的全国血站核酸扩增检测项目的室间质量评价,如果实验室同时运行,1,个以上的独立的核酸检测系统，则需分别参加室间质量评价,做好室内质量控制和室间质量评价,认真细致,精益求精,防微杜渐,