第3章-真菌生物学检验基本技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 真菌生物学,检验基本技术,第一节 概 述,真菌（,Fungus,）,具有典型细胞结构（细胞核、细胞器、细胞壁）,细胞壁含几丁质和（或）纤维素,无根、茎、叶，不含叶绿素,以腐生或寄生方式摄取养料,能进行有性生殖和（或）无性繁殖,对人类致病的真菌分为：,浅部真菌：,侵犯皮肤、毛发、指甲，为慢性，顽固性，但影响身体较小；,深部真菌：,可侵犯全身内脏，严重的可引起死亡。,此外，有些真菌寄生于粮食、饲料、食品中，能产生毒素引起,中毒性真菌病,。,一、生物学性状,细胞壁为,几丁质,(Chitin),（多聚,N,乙酰葡萄糖组成），,并含,葡聚糖，甘露聚糖及蛋白质，,某些酵母菌还含,类脂体。,细胞内有较为典型的,核结构和细胞器,。,（一）形态结构,真菌的形态,单细胞真菌,呈圆形或椭圆形。以出芽方式繁殖。主要为酵母菌和类酵母菌，如隐球菌、念珠菌。,多细胞真菌,由菌丝和孢子组成。菌丝分枝交织成团，形成菌丝体（,Mycelium,），并长有各种孢子。通常称之为丝状菌或霉菌（,Mold,）。,二相性真菌,（,dimorphic fungus,）：孢子与菌丝可随生存环境（营养、温度、氧气等）的变化发生互变,，,如球孢子菌、组织胞浆菌及芽生菌,。,多细胞真菌的形态构成,菌 丝,营养菌丝（伸入到培养基内）,气生菌丝 生殖菌丝（露出于培养基表面）,孢 子,有性孢子,由同一菌体或不同菌体上的二个细胞融合形成,绝大多数属于非致病性真菌所具有,无 性 孢 子,分生孢子,分生孢子梗的顶端或侧面,大分生孢子,小孢子菌属、,表皮癣菌属,小分生孢子,毛癣菌属,叶状孢子,菌丝细胞直接形成,芽生孢子,隐球菌、念珠菌,关节孢子,球孢子菌、毛孢子属,厚膜孢子,新型隐球菌,子囊孢子,菌丝末端形成膨大的囊状结构即孢子囊，内含很多孢子,根霉菌,鹿角状菌丝,菌丝,梳状菌丝,螺旋状菌丝,结节状菌丝,球拍状菌丝,大分生孢子,分生孢子梗,顶囊,真菌孢子和细菌芽胞的区别,真菌孢子,细菌芽胞,抵抗力,不强。,60-70,短时间杀死,强。,煮沸短时间不死,数目,一条菌丝可产生多个孢子,一个细菌体只形成一个芽孢,作用,为繁殖方式之一,不是繁殖方式,形成位置,可在细胞内外形成,只在细菌细胞内形成,形状,形态、色泽多样,圆形或椭圆形,真菌菌落类型,类型,定义,特征,颜色,举例,酵母型菌落,为单细胞真菌的菌落，形态与一般细菌菌落相似，以出芽形式繁殖,光滑、湿润，,一般为乳白色,新型隐珠菌,类酵母型菌落,外观似酵母菌落，但可见,伸入培养基中的假菌丝,，由伸长的芽生孢子形成,光滑、湿润，,一般为乳白色,白色念珠菌,丝状菌落,为多细胞真菌的菌落，由许多管状、分枝菌丝体组成,绒毛状、絮状、粉末状、颗粒状、石膏状。,可产生各种色素。,毛癣菌,（三）变异性,真菌,易发生变异,，在人工培养基中多次传代或孵育过久，可出现,形态结构,、,菌落性状,、,色素,及,毒力,等改变。,二、致病性与免疫性,1.,真菌性感染：,主要是外源性感染,浅部真菌侵犯皮肤、指甲及须发等组织，顽强繁殖，发生机械刺激损害，同时产生酶及酸等代谢产物，引起炎症反应和细胞病变。,深部真菌侵犯皮下，内脏及脑膜等处，引起慢性肉芽肿及坏死。,（一）致病性,2.,条件致病性真菌感染：,主要是内源性感染（如白色念珠菌），亦有外源性感染（如曲霉菌）。,条件：,慢性消耗性疾病。糖尿病、白血病、长期应用化疗、皮质类固醇激素的患者。免疫力低下，菌群失调。,3,过敏性真菌病：,由真菌性过敏原（如孢子抗原）引起过敏症，如哮喘，变态反 应性肺泡炎和癣菌疹等。,4,真菌毒素中毒症：,侵犯害肝、肾、脑、中枢神经系统及造血组织。如黄曲霉毒素、某些镰刀菌素和黑葡萄穗素。,三、微生物学诊断,常见标本的类别,各种分泌物，包括泌尿生殖道分泌物、耳垢、痰及其他；皮肤的角质性物质 如毛发、指（趾）甲、鳞屑及其他；脓汁及渗出物；血液及体液，体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等；粪便和尿液；活组织标本；环境中各种标本材料。,（一）直接检查,1,不染色标本的直接镜检：,直接采取标本制片、显微镜下直接观察，若发现真菌菌丝或孢子存在时，即可初步判定为真菌感染。,1,）标本制备：,2,）检查方法：,3,）封固液：,注意事项,采取部位要恰当。深部真菌感染可采取脓汁、痰液、血液、脑脊液等。浅部真菌感染，应刮取病变部位边缘的痂、鳞屑。发癣应取折断的病发等。,标本应新鲜。特别是深部真菌标本，尽量在取材后立即检查，最长不得超过两小时，如不能立即送检则必须放入冰箱中保存，尽速送检。,应在用药前采集标本。如已用药则需停一段时间药后再采集标本。,标本的采集量要充足。血液和脑脊液不得少于,5ml,，胸腔液不得少于,20ml,。活体组织要采取两份，一份送病理科检查，一份送镜检和培养。,避免污染杂菌。必须进行严格的无菌操作，必要时在培养基内加入抗生素类。,2,染色标本检查：,革兰氏染色：,各种真菌均为,革兰氏阳性，为深蓝色,。常用于酵母菌、白色念珠菌、孢子丝菌、诺卡菌及组织胞浆菌等。,乳酸酚棉蓝染色,糖原染色：菌体均染成红色。用于标本直接涂片及组织病理切片染色。,嗜银染色（,GMS,）：染成黑色。,粘蛋白卡红染色法（,MCS,）：,主要用于新型隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。,荧光染色：,主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。,菌,种,荧光反应,菌,种,荧光反应,白色假丝酵母菌,黄绿色,曲菌,绿色,新生隐球菌,红色,鼻孢子菌,红色,组织胞浆菌,红黄色,球孢子菌,黄绿色,皮炎芽生菌,黄绿色,常见深部真菌的荧光反应,（二）培养检查,用于确定菌种，辅助直接检查的不足；,通常用沙保氏培养基,(Sabouraud,含,1,蛋白胨、,4,葡萄糖或麦芽糖、,2,琼脂,),（,SDA,）,22-28,；,深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂,37,培养。,小培养法：小培养法是采用真菌培养板或普通载玻片进行真菌培养。培养物可直接于显微镜下检查，也可经染色后观察。,（三）免疫学试验,用于检测深部感染真菌的,抗体,，作为辅助诊断组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。,检测深部感染真菌的,抗原，,用于早期、快速、特异的诊断。,乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原,ELISA,法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原,免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶性抗原,四、防治原则,真菌感染尚无特异预防，主要注意公共卫生和个人卫生；,碘化物治疗孢子丝菌病、毛霉菌病有一定疗效；,制霉素、灰黄霉素、克霉唑（三苯甲霉唑）等外用或内服对癣症和白色念珠菌病等有较好疗效；,近年报道,5-,氟胞嘧啶（,5-FC,）治疗单细胞真菌感染疗效显著；,二性霉素,B,可用于深部全身真菌感染。,第二节浅部真菌,主要为丝状菌，多侵犯皮肤、毛发、指甲等角化组织引起癣症，又称皮肤癣菌,(Dermatophytes),。分为三属，共,37,个种。,一、生物学特征,皮肤癣菌的特征,属名,种数,侵犯部位,形态特征,皮肤,指甲,毛发,大分生孢子,小分生孢子,菌 丝,毛癣,菌属,21,+,+,+,细长、棒形、壁薄，,少见或无,梨形、棒形，,较多见,螺旋状、鹿角状、结节状、球拍状、破梳状，单纯细菌丝,小孢子癣菌属,15,+,-,+,纺锤形，壁较厚，,较多见,棒形，卵圆形，,较少见,球拍状及破梳状菌丝,表皮癣菌属,1,+,+,梨形、壁较薄，,多见,无,单纯菌丝,角层癣菌,枇糠状鳞斑癣菌可引起汗斑,皮肤癣菌,含毛癣菌、表皮癣菌和小孢子癣菌三个属，主要侵犯角化的表皮、毛发和指（趾）甲，引起皮肤癣病，包括手足癣、体癣、灰指甲、头癣等。,二、检验方法,直接采取病变部位的标本，用显微镜检查有无菌丝及孢子的存在，本法迅速简便，是临床真菌检查最常用的方法。,（一）直接镜检,皮下组织感染真菌,包括着色真菌和申克孢子丝菌。着色真菌可引起着色真菌病、肢体橡皮肿等；申克孢子丝菌可引起孢子丝菌下疳,也可引起深部感染。,取毛发、皮屑、甲屑等标本，用,70,乙醇消毒，接种沙保氏琼脂斜面培养基，,25,，,7-14,天。根据菌落形态及颜色、并挑取菌落镜检菌丝及孢子的特征进行鉴定。,（二）分离培养,本法主要用于头癣检查。病发在滤过紫外灯照射下可发出不同色泽的荧光，如黄癣菌病发呈暗绿色荧光，白癣小孢子菌属的病发呈亮绿色荧光等。,（三）荧光检查,第三节深部感染真菌,深部真菌是侵犯皮下组织和内脏，引起全身性感染的真菌。,多数能引起慢性肉芽肿样炎症、溃疡及坏死等病变,致病性真菌,正常人体内部不存在，一旦侵入机体，即可致病，如组织胞浆菌、球孢子菌、芽生菌等。属外源性感染致病菌；,条件致病性真菌,是人体正常菌群的成员，当机体抵抗力和免疫力下降时可致病，如新型隐球菌、白色念珠菌、曲霉菌和毛霉菌等。,深部感染真菌分类,一、白色念珠菌,白色念珠菌（,canidia Albicans,）又称白色假丝酵母菌，广泛存在于自然界，也存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病。,为条件致病性真菌。,（一）生物学特性,卵圆形，大小,2m4m,，革兰氏染色阳性。,有假菌丝。,培养特性：典型类,酵母型菌落,，表面光滑，呈灰白色或奶油色，有酵母气味涂片镜检，可看到表层为,卵圆形芽生细胞,，底层有,较多假菌丝,。,（二）致病性和免疫性,可侵犯人体多处部位，可引起：,皮肤念珠菌病：好发于皮肤皱褶处；,粘膜念珠菌病：鹅口疮、口角炎、阴道炎最多见。,内脏及中枢神经念珠菌病：肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎、脑炎等。,机体可产生一定免疫力。,白假丝酵母菌,在免疫力低下、菌群失调等情况下念珠菌可引起皮肤黏膜、内脏、中枢神经等各个部位的感染，称为念珠菌病如鹅口疮、呼吸道炎症等。,革兰氏阳性，圆形或卵圆形，以出芽方式繁殖；培养特性，普通培养基生长良好，酵母型菌落。,（三）检验方法及鉴定,1,直接镜检：革兰氏染色镜检。,2,培养特点：典型的酵母菌落。,3,鉴定试验：,芽管试验；,TZC,试验；糖发酵和糖同化试验；动物实验；厚膜孢子形成试验。,4,血清学诊断：以念珠菌为抗原测定机体抗念珠菌抗体，用于诊断全身性念珠菌病。,芽管试验：取少许待检的白色念珠菌接种于,0.5ml,人或兔血清中，混匀，直,37,水浴,2-3h,后，取出一接种环菌液，涂片、镜检。有芽管产生者为白色念珠菌，其他念珠菌不产生芽管。,TZC,试验：将菌接种于含,0.005,氯化三苯基四氮唑的沙保培养基中，经,22-25,，,24-48h,培养。白色念珠菌不变色或仅为淡红色，其他念珠菌或酵母菌呈红色或深红色。,糖发酵和糖同化试验：根据这两种试验可将常见的几种念珠菌进行鉴别。,糖同化试验：将,1%,的各类糖浸入直径,6-10mm,的,4,号新华滤纸片。将纸片干燥后放,-20,备用。制备无营养成份的固体琼脂平板（,9-12cm,）。将,0.5,浊度待检菌均匀涂布于以上平板上，贴上不同的以上含糖纸片。,35,，,24-48h,。若某糖纸片四周有明显的细菌生长，则为此糖同化试验阳性。,动物实验：,本菌对兔有致病力。兔耳静脉注射本菌，经,4-5,天死亡。解剖可见肾、肝肿胀、充血，并有小脓肿，涂片及培养均可见本菌及其假菌丝存在。,厚膜孢子形成试验：,本试验亦是鉴定白色念珠菌的重要方法之一，在玉米粉聚山梨酯,80,琼脂培养基培养本菌，镜检观察到厚膜孢子及假菌丝。,二、新型隐球菌,又名溶组织酵母菌，是土壤，鸽类，牛乳、水果等的腐生菌，也可存在人口腔中。,可侵犯人和动物，一般为外源性感染，但也可能为内源性感染，对人类而言，它通常是条件致病菌。,（一）生物学特性,较大球形，直径可达,5-20um,，,有肥厚的荚膜，折光性强，一般染料不易着色，难以发现，称隐球菌，,用墨汁阴性显影法镜检，可见到透明荚膜包裹着菌细胞，,菌细胞常有出芽，但不生成假菌丝。,在沙保氏琼脂及血琼脂培养基上，于,25,及,37,皆可生长，而非病原性隐球菌在,37,不能繁殖。,酵母型菌落，呈白色。,本菌能分解尿素，以此与酵母菌和念珠菌鉴别。,（二）致病性,本菌多由呼吸道转入，在肺部引起轻度炎症，或隐性传染。,可侵犯中枢神经系统，发生脑膜炎、脑炎、脑肉芽肿等。,还可侵入骨骼、肌肉、淋巴结、皮肤粘膜引起慢性炎症和脓肿。,新生隐球菌大量存在于干燥的鸽粪中，通过呼吸道感染人类，引起隐球菌病。,菌体外有肥厚的荚膜，菌体常有出芽。在沙氏培养基生长良好，为酵母型菌落。,为条件致病菌，发生于肺部，能自愈，严重者可爆发型感染，血行播散，导致死亡。,传染源：鸽粪,传播途径：呼吸道,（三）微生物学检验,1,直接镜检：常用墨汁涂片法。,2,分离培养：,沙保培养基上，室温或,37,，,2-3,天即可长出典型酵母型菌落。有荚膜者菌落粘稠。,3,糖同化及发酵试验：,本菌不发酵各种糖类,，但能同化葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、肌醇，不同化乳糖。,4.,酚氧化酶试验：,在含,-,多巴橘橼酸铁和咖啡酸培养基中，经,-,天培养，新型隐球菌可产生,3,4,二羟基苯丙氨酸,-,酚氧化酶，氧化,O-,联苯酚呈棕黑色菌落。,.,尿素酶试验：新型隐球菌产生尿素酶，在尿素培养基（含尿素及酚红指示剂）中分解尿素形成氨和,CO,2,，以致培养基的,pH,值升高，使酚红由黄变为粉红色为阳性，而白色念珠菌为阴性。,曲霉菌,广泛分布于自然界，引起的疾病包括肺曲霉病（真菌球型肺曲霉病、曲霉肺炎、过敏性支气管肺曲霉病）、全身性曲霉病、毒素中毒、致癌，黄曲霉菌能诱导肝癌发生。无有效的预防措施，治疗可采用抗真菌药物。,毛霉菌,广泛存在于自然界的腐生菌，常引起食物发生霉变，是一种条件感染性真菌，感染首发于鼻及耳部，引起坏死性炎症和肉芽肿，可扩散至全身，引起死亡。,肺孢子菌,为条件感染性真菌，引起肺孢子菌肺炎，为国外爱滋病患者最常见的并发症和致死原因，无有效的预防方法。,微生物检验,标本直接镜检,微生物鉴别,抗原检测,核酸检测,抗体检测,