第七章免疫技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章 免疫学技术,Immunotechnology,第一节 基本技术,(一)、分离纯化抗原或抗体的一般理化技术,、沉淀法,常用有机溶剂沉淀法、盐析法，用于蛋白粗提。,2、过滤法,也称分子筛，一般用凝胶层析，为不完全筛。常用有葡聚糖、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。,3、离子交换色谱法,常用有离子交换纤维素、离子交换葡聚糖等。,4、亲合色谱法,常用有抗原或抗体交联葡聚糖、琼脂糖凝胶、戊二醛等。,5、电泳法,1)区带电泳(,Zone electrophoresis),2),免疫电泳,6、离心法,(二)、制备单克隆抗体的方法,在免疫学实验中常需要取得纯化的特异性抗体。单克隆抗体是利用细胞杂交技术形成可分泌某种特异性抗体的肿瘤细胞，进行持续传代而获得的特异性抗体。经典模式为通过抗原免疫动物(通常为小鼠)获得有关,B,细胞，使其与同系骨髓瘤细胞融合，选择出能产生针对该抗原的特异性抗体的稳定杂种瘤细胞，既有可持续传代的肿瘤细胞特性又有可分泌特异性抗体的特性,第二节 体外抗原抗体反应及其应用,1、体外抗原抗体反应,2、经典的血清学反应,3、免疫标记技术,体外抗原抗体反应,抗原抗体反应,1、抗原抗体的结合与析出,2、抗原抗体反应的特点,3、抗原抗体反应的影响因素,引起抗原抗体结合的作用力,1、电荷引力（库仑引力2、电子云引力（,Van,der Waals,力）,3、氢键结合力,4、疏水作用力,抗原抗体结合物析出的原因,析出,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,电解质,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,抗原抗体反应的特点,1、特异性,2、适合比例性,3、可逆性,特异性,抗原,A,抗原,C,抗原,B,特异性反应,交叉反应,无反应,适合比例性,抗体含量,抗原含量,前带,后带,等价带,网格学说,（,lattice theory）,抗体过剩,抗原过剩,抗体抗体比例合适,可逆性,K（,亲和常数）=,Ag+,Ab,Ag,Ab,抗原抗体反应的影响因素,1、,电解质,2、酸碱度（,pH,值6-8）,3、温度（37-42,。,C）,经典的血清学反应,经典血清学反应的种类,类型 抗原 抗体 辅助物 敏感度（,g,抗体氮）,凝集反应 颗粒性 凝集素 0.01,沉淀反应 可溶性 沉淀素 5-10,溶血（菌）红细胞 溶血素 补体 0.001-0.3,反应,G-,细菌 溶菌素 补体 （同上）,补体结合 固定补 补体,反应 体抗体,SRBC,溶血素 0.1,中和反应 外毒素 抗毒素 靶细胞 0.01,病毒 中和抗体 靶细胞 （同上）凝集反应,直接凝集反应,颗粒性抗原,凝集素,正向间接凝集反应,可溶性抗原,载体颗粒,反向间接凝集反应,抗体,可溶性抗原,载体颗粒,间接凝集抑制反应,凝集,凝集抑制,待检样品,待检样品,Coombs,试验,抗人免疫球蛋白,沉淀反应,液相内沉淀反应,絮状沉淀反应,环状沉淀反应,+,+,抗血清,抗原,抗原,抗体,免疫比浊,凝胶内沉淀反应,免疫扩散技术,免疫电泳技术,单向扩散试验,双向扩散试验,火箭电泳,对流电泳,免疫电泳,免疫标记技术,主要的免疫标记物,类别 标记物 用途,荧光素,FITC、RB200、TRITC,免疫组化,镧系元素螯合物 免疫分析测定,放射性核素,3,H、,14,C、,32,P、57,Gr,免疫分析测定,125,I、,131,I,酶,HRP、AP,免疫组化,免疫分析测定,化学发光物,Luminol,、,lucigenin,免疫分析测定,金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化,免疫分析测定,标记免疫技术的分类,一、按测定用途分类：,1、免疫组化技术,2、免疫测定技术,二、按标记物分类：,1、酶免疫技术,2、荧光免疫技术,3、放射免疫技术,4、发光免疫技术,5、金免疫技术,免疫荧光技术,直接法,间接法,补体法,双标记法,放射免疫分析,结合相,游离相,1 2 5 10 20 50 100,40,30,20,10,未标记抗原含量,结合、游离相放射性含量比值,酶联免疫吸附试验,ELISA,间接法,夹心法,竞争法,第三节 免疫细胞检测技术,1、细胞表面标志检测,2、细胞功能检测,3、细胞因子检测,表面标志检测,常用的免疫细胞表面标志检测技术,一、免疫标记检测,1、荧光抗体法,2、酶免疫检测法,3、免疫金银染色法,二、补体依赖的细胞毒试验（,CDC）,三、花环形成试验,1、,E,花环,2、,EA,花环,3、,EAC,花环,SmIg,的荧光抗体检测法,SmIg,的酶免疫检测法,补体依赖的细胞毒试验,（,CDC）,染料,补体,E-,花环,T,细胞,B,细胞,花环形成细胞,绵羊红细胞,EA-,花环,EAC-,花环,细胞功能检测,一、转化、增殖试验,1、淋巴细胞转化试验,2、混合淋巴细胞培养,二、细胞毒检测,1、,T,细胞介导的细胞毒试验,2、,NK,活性测定,3、,ADCC,作用测定,常用的免疫细胞功能检测技术,放射性测定,3,H-,TdR,丝裂原（抗原）刺激,淋巴细胞转化试验原理示意,放射性测定,细胞毒试验原理示意,靶细胞,效应细胞,分离上清,细胞因子检测,可检测的细胞因子,白细胞介素（,Interleukin,）IL-1、IL-2、IL-18,干扰素（,Interferon）IFN-,、IFN-、IFN-,肿瘤坏死因子（,Tumor necrosis factor）TNF-、TNF-,集落刺激因子（,Colony-stimulating factor）M-CSFG-CSF,转化生长因子（,Transforming growth factor）TGF-,趋化因子（,Chemokine,）IL-8、,GROs,、MCP-1,生长因子（,Growth factor）EGF、FGF、IGF、PDGF,细胞因子检测的特点,1、免疫原性较弱,2、样品含量低,3、样品具有时效性,4、生物效应特异性差,细胞因子检测的方法,1、免疫标记技术检测抗原性测定,2、细胞生物学方法检测生物活性测定,3、分子生物学技术检测,mRNA,表达测定,细胞因子生物学方法检测的类型,一、细胞增殖试验,二、细胞病变保护试验,三、细胞毒试验,四、趋化试验,待检样品（细胞上清）指示细胞（,CTLL-2）,按不同稀释度加入,37,C，16-20,小时,加入,3,HTdR,（1-5,Ci,）,37,C，4-6,小时,收集细胞,测定,白细胞介素-2的测定示意图,待检样品（细胞上清）指示细胞（,L929）,按不同稀释度加入,37,C，4,小时,37,C，24-48,小时,弃取上清，加入,VSV,观察细胞病变（镜检或比色）,干扰素的测定示意图,肿瘤坏死因子的测定示意图,待检样品（细胞上清）指示细胞（,L929）,按不同稀释度加入,37,C，24,小时,弃取上清，洗涤,加入结晶紫染液，洗涤,加入细胞裂解液，比色,