第二章 基因工程及其在食品科学中的应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第二章 基因工程及其在食品科学中的应用,第一节 基因工程基础,三、基因工程的载体,基因工程的载体,(vector),概念,基因工程载体的分类：,按照介导的作用目的；按照导入的受体,（一）大肠杆菌载体,分为：,质粒载体；噬菌体载体；柯斯质粒,(,黏粒,),载体,1,、质粒载体,(1),质粒的生物学特性,质粒,(plasmid),：是指细菌等生物细胞内一类独立于染色体外而能,自我复制,的,遗传物质,，一般为,双链,(double strand,，,ds,),的共价闭合环状,DNA,(covalently,closed,circularDNA,，,cccDNA,).,质粒依赖于,宿主编码的酶,和,蛋白质,进行复制和转录，是宿主的,共生物,质粒的,不亲和性,(plasmid incompatibility),，也称,不相容性,，是指在没有选择压力的情况下，,两种亲缘关系密切,的,不同质粒,不能在同,一宿主细胞中稳定共存的现象,彼此不相容的质粒属于,同一个不亲和群,(incompatibility group),，而彼此能够共存的亲和质粒则属于,不同的不亲和群,(2),质粒的分类,有三种分类方法：,根据赋予,宿主的遗传性状分类,、根据,转移能力分类,和根据,复制控制类型分类,。,根据赋予宿主的遗传性状，一般大肠杆菌质粒可分为,F,因子,(,性因子,),、,R,质粒,(,抗药性因子,),、,Col,质粒,(,产生大肠杆菌素因子,),等,根据转移能力，一般可将大肠杆菌质粒分为,接合型质粒,和,非接合型质粒,根据复制控制类型，一般可将大肠杆菌质粒分为,严紧型复制控制质粒,（,stringent,plamid,）和,松弛型复制控制质粒,（,relaxed plasmid,）,（,3,）质粒载体的条件及选择,质粒克隆载体,是指能将外源基因携带至宿主细胞并可在其中自主复制的质粒,DNA,理想的质粒克隆载体一般具备以下条件：,分子结构中具有多个单一限制酶切位点，具有易被检测的选择标记基因，且切点位于选择标记基因上；能插入、运载一定大小的外源基因；在宿主细胞内能自主复制；在与外源基因构建重组质粒后具有转化功能；分子量小，易于操作，一般为松弛型复制控制；容易控制，安全可靠。,（,4,）质粒载体例解,pBR322,：它曾是一种应用最为广泛的,克隆载体,，现许多应用广泛的质粒载体都由其衍生而来。其带有,氨苄青霉素抗性基因,amp,r,，四环素抗性基因,tet,r,两个选择标记基因，属于松弛型复制控制质粒载体,pBR322,的结构,为了方便起见，统一规定该环状质粒载体,DNA,分子中核苷酸的计数从,EcoR,I,的识别序列,开始。在该识别序列,GAATTC,中，以,第一个,T,为核苷酸,1,，然后沿着从tet,r,基因,到,amp,r,基因,的方向顺序计数，如此画出该质粒的碱基序列结构图,Bluescript,Ml3+,、,Bluescript,Ml3-,：,是一对带有,M,13,噬菌体,DNA,复制起点,ori,的质粒载体。这对载体可在体内或在体外产生互补于插入到其多克隆位点的外源双链,DNA,中任一条链的单链,DNA,或,RNA,。,2,、噬菌体载体,（,1,）噬菌体的生物学特性,噬菌体,(,bacteriophage,),是一类,细菌病毒,的总称,噬菌体颗粒的外壳是,蛋白质,，内部是,核酸,噬菌体的,感染效率极高,。,噬菌体的生命周期可分为,溶菌周期,和,溶原周期,溶菌周期,是指噬菌体吸附到宿主细胞表面后注入,DNA,，经过,DNA,复制及蛋白质合成，组装成,子代噬菌体颗粒,，最后使宿主细胞破裂，释放出子代噬菌体颗粒的生长周期,溶原周期,是指噬菌体在感染过程中,不产生,子代噬菌体颗粒，而将噬菌体,DNA,整合到宿主细胞染色体,DNA,中；成为其组成部分的生长周期,只具有溶菌周期的噬菌体被称为,烈性噬菌体,。,具有溶原周期的噬菌体被称为,温和噬菌体。,烈性噬菌体的生活周期,裂解循环,溶源态,温和噬菌体,的生活周期,具有一套,噬菌体完整基因组,的细菌被称为,溶原性细菌,(1ysogen),。以温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶原性细菌的过程被称为,溶原化,(1ysogenization),。,整合的噬菌体,DNA,是指插入宿主细胞染色体,DNA,中的噬菌体,DNA,；而以质粒,DNA,分子形式存在的噬菌体,DNA,被称为,非整合的噬菌体,DNA,。,噬菌体的侵染循环,（,2,）,噬菌体载体,噬菌体是,大肠杆菌的噬菌体,，它由,外壳蛋白,和,DNA,组成，,噬菌体颗粒由,头,与,尾,两部分组成。头部装载了其整个基因组,DNA,。,DNA,为一长度约,48.5kb,的线状双链,DNA,分子，可以分为三个区段：左臂、中央区和右臂。在左臂和右臂的,5,处各有一,12,个碱基长的互补单链,(,从而构成黏性末端,),。,DNA,的结构,DNA,为,线状双链,DNA,分子,，两端各有一个,12,核苷酸的互补单链（粘性末端）,GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA,，当入噬菌体感染宿主细胞时，,DNA,被注入宿主细胞后会迅速通过黏性末端的互补作用形成,环状双链,DNA,分子,，,这种由黏性末端结合形成的双链区段称作,cos,位点,(cohesive-end site),。,噬菌体在宿主细胞中繁殖时，,复制的,DNA,必须被包装到已组装好的,头部,，并再,接上尾巴,后才能成为,成熟的噬菌体颗粒,，才具备,感染大肠杆菌细胞的能力,。噬菌体要具有感染性，被包装的,DNA,必须具有一定的长度。野生型,噬菌体,DNA(48.kb),被包装的效率最高，并且所形成的噬菌体颗粒具有最强的感染性。如果被包装的,DNA,与入噬菌体载体的总长度短于野生型,DNA,长度的,78,或者长于野生型,DNA,长度的,105,，,那么就不能形成具有感染性的噬菌体颗,噬菌体载体中取代了非必要基因的外源基因可随宿主细胞一起复制和增殖。,DNA,噬菌体载体的优点,:,可携带较长的外源,DNA,片段。,重组后的,DNA,分子可在体外被包装成噬菌体颗粒。与用,DNA,直接转染细菌相比，包装成的噬菌体颗粒具有更强的感染宿主细胞的能力。,重组的噬菌体容易筛选和贮存。,噬菌体载体的分类,:,一般可将入噬菌体载体分为,插入型载体,和,置换型载体,。,插入型载体,(insertion vector),，是指在基因组的非必要基因区内有一种或不止一种限制酶的单一酶切位点可供外源,DNA,插入，而不缺失其本身任何片段的,噬菌体载体,置换型,(,取代型,),载体,(replacement vector),，是指在基因组的非必要基因区内两个或两个以上的限制酶切位点间的,DNA,区段可被插人的外源,DNA,片段所置换的,噬菌体载体,噬菌体载体的选择,:,并没有一种可以适于克隆所有,DNA,片段的入噬菌体载体。,具体选择时，应该考虑以下几点：,如果要从染色体,DNA,来构建基因组文库，那么可以选择置换型的,噬菌体载体，因其可容纳,DNA,较大片段。,如果要从染色体,DNA,中分离某一基因，而又不需构建完整基因组文库，那么选择的自由度就较大。,如果需要构建,cDNA,文库，那么常选,gt10,或,gt11,插入型载体；如果考虑选用抗体探针，那么常选,gt11,这一有效表达载体,。,（,3,）,M13,噬菌体载体家族,M13,噬菌体的侵染循环,M13,噬菌体的侵染循环,M13,噬菌体的特性,M13,是,丝状噬菌体,，含有长度为,6407,个核苷酸的,闭合环状单链,DNA,基因组,。当,M13,感染宿主大肠杆菌细胞时，侵入的单链噬菌体,DNA,转变为,双链复制型,(RF),。,双链复制型在复制时产生大量的,单链,DNA,。单链,DNA,再被外壳蛋白包装为,成熟的噬菌体颗粒,。,在宿主大肠杆菌细胞生长过程中，子代噬菌体颗粒被释放出来。,M,13,噬菌体载体的优点,A,由于,M,13,单链,DNA,的复制型呈双链环形，因此，此时的,DNA,可同质粒,DNA,一样进行提取和体外操作；,B,不论是双链的还是单链的,M,13,DNA,均能感染宿主细胞，产生噬菌斑或形成侵染菌落；,C,由于,M,13,是丝状噬菌体，其长度不受外壳蛋白包装的限制，因此根据重组,DNA,的长度，被包装成的噬菌体颗粒可大可小。,3,、柯斯质粒载体,柯斯质粒载体,(,Cosmid,vector),，也称,黏粒载体,。,是指一类由,人工构建,的含有,DNA,的,cos,位点,和,质粒复制子,的特殊类型的质粒载体。其最初是为克隆和增殖基因组的大片段,DNA,而设计的。,(1),柯斯质粒载体的组成,柯斯质粒本身的分子量较小，一般为,4,6kb,。其基因组由以下部分组成：,1,个质粒,复制起始区域复制子,；,至少,1,个,抗药性选择标记基因,；,至少,1,个,限制酶的单一识别切割位点,；,1,个,噬菌体黏性末端片段,cos,位点,。,Cos,质粒,pJB8,(2),柯斯质粒载体的特点,具有质粒载体的特性,：它带有质粒的复制子，因此能像质粒,DNA,一样在寄主细胞内复制，也能在,氯霉素,的作用下进行扩增，也带有,抗菌素抗性基因,具有,噬菌体载体的特性：,它在与适宜长度的外源,DNA,片段,重组,后，可在体外包装成,噬菌体颗粒,，并能高效地转入对,噬菌体敏感的大肠杆菌宿主细胞,具有高容量的克隆能力：,质粒载体的克隆容量一般为,10kb,，,噬菌体载体的克隆容量理论极限值是,23kb,，一般为,15kb,左右，而柯斯质粒载体的克隆极限可达,45kb,左右,(,二,),酵母载体,酵母是,单细胞低等真核生物,，其基因组大小仅为大肠杆菌基因组的,4,倍,。酵母可人工培养，且繁殖迅速，并可像细菌一样进行实验操作。酵母的生命周期包括,单倍体,和,二倍体,两种形式，它对基因表达产物有完善的后加工系统,。,1,、酵母载体的特点,能在大肠杆菌中克隆，且具较高的拷贝数。,含有在酵母中便于选择的遗传标记,含有合适的限制酶切割位点，以便外源基因的插人。,2,、酵母载体的分类,根据复制方式，一般可将酵母载体分为,整合型载体,、,复制型载体,和,附加体型载体,(1),整合型载体,(YIP),该类载体由,大肠杆菌质粒,和,酵母,DNA,片段,构成。由于其酵母,DNA,片段提供的亮氨酸基因,(,leuZ,+),部分不含有自主复制起始区，而只作为选择标记，因此该类载体在酵母细胞中,不能自主复制,。,(2),复制型载体,(YRP),该类载体是将酵母,DNA,片段插入到,大肠杆菌质粒,中构成的。其中酵母,DNA,片段不仅提供了选择标记，还携带来自,酵母染色体,DNA,的自主复制顺序,(ARS),。因为同时含有,大肠杆菌和酵母的自主复制基因,，所以该类载体能在这两种细胞中存在和复制。因此，该类载体属于,穿梭载体,。,所谓,穿梭载体,(shuttle vector),，是指,可在两种截然不同的生物细胞中复制的载体,(3),附加体型载体,(YEP),该类载体一般由,大肠杆菌质粒,、,2m,质粒,及,酵母染色体,的选择标记组成。,YEP,的结构,(,三,),植物载体,植物载体,具体包括,农杆菌质粒载体,、,病毒载体,等，,农杆菌质粒载体,又可分为,根癌农杆菌,(,Agrobacterium,tumefaciens,，,At),诱导肿瘤质粒,(tumor-inducing plasmid,，,Ti plasmid),载体,和,发根农杆菌,(,Agrobacterium,rhizogenes,，,Ar,),诱导发根质粒,(root-,inducingplasmid,，,Riplasmid,),载体。,在所有这些植物载体中，,根癌农杆菌诱导肿瘤质粒载体是最主要的,根癌农杆菌主要感染被子植物中的双子叶植物。,根癌农杆菌感染植物会致其形成,冠瘿瘤,，而这种肿瘤的形成是由,根癌农杆菌中的质粒引起的,。因此，该质粒被称为诱导肿瘤质粒，简称,Ti,质粒,。,1,、,Ti,质粒的基本性质,Ti,质粒,是,根癌农杆菌染色体外的遗传物质,，为共价闭合环状的双链,NA,分子。其分子量为,1.2X10,8,，长约,185kb,，相当于细菌染色体的,3,一,5,。,根据植物冠瘿瘤中所合成的,冠瘿碱,的种类，一般可以将,Ti,质粒分为以下类型：,章鱼碱型,(,octopine,),、,胭脂碱型,(,nopaline,),、,农杆碱型,(,agropine,),等。,2,、,Ti,质粒的基本结构,一般可将,Ti,质粒分为四个结构区域：,T-DNA,区,、,Vir,区,、,Con,区,和,Ori,区,。,(1),T-DNA,区,(transferred-DNA region),。,T-DNA,是在根癌农杆菌侵染植物细胞时，从,Ti,质粒上切割下来转移到植物细胞内的一段,DNA,，因此，被称为,转移,DNA,。该,DNA,片段上的基因与肿瘤的形成有关。,(2),Vir,区,(virulence region),。该区段上的基因能够,激活,T-DNA,转移,，使根癌农杆菌表现出毒性，因此，被称为,毒性区,。,(3),Con,区,(region encoding conjugation),。该区段上存在着与细菌间,接合转移,有关的基因,(,tra,),，调控,Ti,质粒在根癌农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活,tra,基因，诱导,Ti,质粒的转移。因此，该区被称为,接合转移编码区,。,(4),Ori,区,(origin of replication),。该区段上的基因调控了质粒的自我复制，因此，被称为,复制起始区,。,3,、植物基因工程中几种载体的定义,(1),中间克隆载体,(intermediate cloning vector),。这是指插入了,根癌农杆菌,Ti,质粒,T-DNA,片段、目的基因、标记基因等的大肠杆菌质粒载体。它是构建,中间表达载体,的基础质粒。,(2),中间表达载体,(intermediate expression vector),。这是指含有可使,外源基因,在植物细胞中表达的,特异启动子,的,中间克隆载体,。它是构建,植物表达载体,的基础质粒。,(3),卸甲载体,(disarmed vector),。卸甲载体多指去除了编码致瘤作用基因、经改造的根癌农杆菌,Ti,质粒载体。其是构建植物表达载体的受体质粒。,(4),植物表达载体,(plant expression vector),。这是指最后将目的基因导人植物细胞表达的载体。它由中间表达载体和卸甲载体构建而成。,4,、植物表达载体,(1),植物表达载体,(,中间表达载体,),中常用的启动子,。,(2),一元载体系统,共整合载体,(co-integrated vector),拼接末端载体,(split-end vector,，,SEV),(3),双元载体系统,双元载体系统的构建原理,双元载体的构建,(,四,),动物载体,DNA,病毒,是外源,DNA,导入哺乳动物细胞的理想载体。其中，常用的载体由,野生型猿猴空泡病毒,40,(SV40),基因组DNA,等改建而成,。,SV40,病毒,：猿猴空泡病毒,40(simian,vacuolating,virus 40),，即,SV40,病毒，是一种小型,20,面体的颗粒，外壳由,VPl,、,VP2,和,VP3,三种,病毒蛋白,构成，中间包装着长,5.2kb,的环状基因组,DNA,。,SV40,基因组,DNA,分为早期和晚期两大区域。早期区在溶原生长中一直表达，而晚期区仅在,DNA,复制后的一段时间中表达，产生病毒外壳结构蛋白。早期区与晚期区之间则为复制起点。,四、基因工程中的一些主要分子生物学方法,(,一,),核酸分子探针的标记,探针,(probe),是指在化学及生物学意义上能与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法所测定的分子。,核酸分子探针,是指能与互补核酸序列复性杂交的特定已知核酸片段。,根据来源性质，一般可将,核酸分子探针,分为,基因组,DNA,探针,、,cDNA,探针,、,RNA,探针,、,化学合成的寡核苷酸探针,等。,根据标记的方式，可将,核酸分子探针的标记法,分为,体内标记法,和,体外标记法,。，,第二章 基因工程及其在食品科学中的应用,第一节 基因工程基础,(,三,),植物载体,1,、,Ti,质粒的基本性质,Ti,质粒,是,根癌农杆菌染色体外的遗传物质,，为共价闭合环状的双链,DNA,分子。其分子量为,1.2X10,8,，长约,185kb,，相当于细菌染色体的,3,一,5,。,根据植物冠瘿瘤中所合成的,冠瘿碱,的种类，一般可以将,Ti,质粒分为以下类型：,章鱼碱型,(,octopine,),、,胭脂碱型,(,nopaline,),、,农杆碱型,(,agropine,),等。,2,、,Ti,质粒的基本结构,一般可将,Ti,质粒分为四个结构区域：,T-DNA,区,、,Vir,区,、,Con,区,和,Ori,区,。,(1),T-DNA,区,(transferred-DNA region),。,T-DNA,是从,Ti,质粒上切割下来转移到植物细胞内的一段,DNA,，因此，被称为,转移,DNA,。该,DNA,片段上的基因与肿瘤的形成有关。,(2),Vir,区,(virulence region),。该区段上的基因能够,激活,T-DNA,转移,，使根癌农杆菌表现出毒性，因此，被称为,毒性区,。,(3),Con,区,(region encoding conjugation),。该区段上存在着与细菌间,接合转移,有关的基因,(,tra,),，调控,Ti,质粒在根癌农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活,tra,基因，诱导,Ti,质粒的转移。因此，该区被称为,接合转移编码区,。,(4),Ori,区,(origin of replication),。该区段上的基因调控了质粒的自我复制，因此，被称为,复制起始区,。,3,、植物基因工程中几种载体的定义,(1)中间克隆载体,(intermediate cloning vector),。这是指插入了,根癌农杆菌,Ti,质粒,T-DNA,片段、目的基因、标记基因等的大肠杆菌质粒载体。它是构建,中间表达载体,的基础质粒。,(2),中间表达载体,(intermediate expression vector),。这是指含有可使,外源基因,在植物细胞中表达的,特异启动子,的,中间克隆载体,。它是构建,植物表达载体,的基础质粒。,(3),卸甲载体,(disarmed vector),。卸甲载体多指去除了编码致瘤作用基因、经改造的根癌农杆菌,Ti,质粒载体。其是构建植物表达载体的受体质粒。,(4),植物表达载体plant expression vector),。这是指最后将目的基因导人植物细胞表达的载体。它由中间表达载体和卸甲载体构建而成。,4,、植物表达载体,(1),植物表达载体,(,中间表达载体,),中常用的启动子,。,(2),一元载体系统,共整合载体,(co-integrated vector),拼接末端载体,(split-end vector,，,SEV),(3),双元载体系统,双元载体系统的构建原理,双元载体的构建,(,四,),动物载体,DNA,病毒,是外源,DNA,导入哺乳动物细胞的理想载体。其中，常用的载体由,野生型猿猴空泡病毒,40,(SV40),基因组,DNA,等改建而成,。,SV40,病毒,：猿猴空泡病毒,40(simian,vacuolating,virus 40),，即,SV40,病毒，是一种小型,20,面体的颗粒，外壳由,VPl,、,VP2,和,VP3,三种,病毒蛋白,构成，中间包装着长,5.2kb,的环状基因组,DNA,。,SV40,基因组,DNA,分为早期和晚期两大区域。早期区在溶原生长中一直表达，而晚期区仅在,DNA,复制后的一段时间中表达，产生病毒外壳结构蛋白。早期区与晚期区之间则为复制起点。,四、基因工程中的一些主要分子生物学方法,(,一,),核酸分子探针的标记,探针,(probe):,是指在化学及生物学意义上能与特定的,靶分子,发生,特异性,相互作用，并可被特殊的方法所,测定的分子,。,核酸分子探针,:,是指带有,标记的,某一特定,DNA,或,RNA,片段，能与待测样本中单链核酸分子,互补配对,结合，进而检测,同源序列,。,核酸探针的类型和称谓常有以下几种：,基因组,DNA,探针,核酸探针,cDNA,探针,(,来源,),RNA,探针,化学合成的寡核苷酸探针,放射性标记探针,32,P,、,35,S,、,3,H,、,125,I,等标记探针,探针标记,(,标记物种类,),非放射性标记探针,生物素、地高辛配体、荧光素,体内标记法,探针标记法 化学标记法,(,方式,),体外标记法,酶促标记法,体内标记法：,将经,放射性同位素标记,的化合物作为底物引入,活细胞,，经细胞代谢处理而将,生物大分子,等加以标记的方法,化学标记法：,利用标记物分子上的,活性基团,与,探针分子上的基团,发生,化学反应,而将标记物接到探针分子上的方法,酶促标记法：,是指将标记物预先标记在,核苷酸上,，然后利用,酶促方法将核苷酸掺入到探针分子中,，或将核苷酸上的,标记基团,交换到,探针分子,上的方法,根据酶促反应的条件，又可将酶促标记法分为,：,切刻平移法,酶促标记法,随机引物法,末端标记法,1,、切刻平移法（,nick translation,）,（,1,）原理,利用,DNaseI,内切酶活性、,DNA,聚合酶,I,的,5 3,聚合酶活性和,5 3,外切酶活性。产生均匀标记的探针。,（,2,）流程,在,Mg2+,的存在下，利用,DNaseI,的内切核酸酶活性,在待标记的,DNA,双链上随机形成,单链切刻,利用,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的,5 3,核酸外切酶活性,在切刻处将旧链从,5,逐步切除,以互补的,DNA,单链为模板，利用,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的,5 3,聚合酶活性,将,dNTP,(,其中一种或几种经过标记,),顺序连接到切刻,3,端的一,OH,上，延伸合成新的,DNA,单链，从而形成,标记的,DNA,探针,。,（,3,）特点,适用于各种,双链,DNA,的标记,，不适用于,单链,DNA,和,RNA,的标记,5 3,3 5,DNaseI,5 3,3 5,逐步切除,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,5 3,核酸外切酶活性,3 5,5 3,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,5 3,聚合酶活性,5 3,3 5,单链探针,标记物来自,DNTP,切刻平移法制备探针的示意图,切刻平移法制备,探针,原理,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,*,*,*,*,*,*,*,*,(a),(b),(c),(d),(e),(a),双链的,DNA,分子,(b),带有,3-OH,末端的单链缺口,(c)pol,从,5-P,移去一个核苷酸,(d)pol,将,32,P,标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸,(e),重复,(c)(d,),的步骤，缺口沿,5-3,方向移动，形成,32,P,标记的核苷酸合成的,DNA,链,2,、随机引物法,随机引物,(random primer),：指含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。,（,1,）原理,随机引物合成双链探针是使,寡核苷酸引物,与,DNA,模板,结合，在,Klenow,酶,的作用下，合成与,模板互补的,DNA,探针,。,（,2,）流程,将待标记的,DNA,双链,变性,形成,单链,与随机引物杂交,以随机引物为引物，待标记的,DNA,单链,为模板，在利用,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的,Klenow,片段的,5,3,聚合酶的作用下,将,dNTP,(,其中一种或几种,经过标记,),按碱基互补的原则顺序连接到切刻,3,端的一,OH,上，以延伸合成新的,DNA,单链，从而形成标记的,DNA,探针。,（,3,）,特点,Klenow,片段没有,53,外切酶活性,反应稳定。,反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒,DNA,模板也可进行反应。,反应产物的活性较高。,随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。,3,、末端标记法,（,1,）基本原理,利用大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的,Klenow,片段、,T4DNA,聚合酶、,T4,多核苷酸激酶或末端脱氧核苷酸转移酶等相应的活性将反应体系中标记核苷酸对,DNA,片段末端进行标记,（,2,）几种方法,大肠杆菌DNA,聚合酶,I,的,Klenow,片段末端标记法,T4 DNA,聚合酶末端标记法,T4,多核苷酸激酶标记法,末端脱氧核苷酸转移酶标记法,(,二,),核酸分子的杂交,核酸分子杂交技术是在,1968,年由华盛顿卡内基学院（,Cavnegie,Institute of Washington,）的,Roy,Britten,及其,同事,发明的。,原理,带有互补的特定核苷酸序列的,单链,DNA,或,RNA,，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会按碱基互补原则复性杂交形成（退火）双链的结构,DNA,与,DNA,杂交：,A=T,、,GC;,DNA,与,RNA,杂交,:A=U,、,GC;,杂交的两条核酸单链分别是,核酸探针,和,待测核酸,分类：,根据待测核酸的提取处理，可将核酸分子杂交主要分为,核酸原位杂交,、,菌落原位杂交,、,斑点狭缝杂交,和,膜上吸印杂交,1,、原位杂交（,nucleic acid hybridization in situ,）,（,1,）基本原理,将标记探针与细胞或组织切片中的待测核酸进行杂交，进而检测待测的,DNA,或,RNA,序列。,细胞原位杂交,组织切片原位杂交,DNA-DNA,RNA-DNA,三类杂交,RNA-RNA,该法优点：,不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。,hybridization,DNA:DNA 5 A T G C C G A T,3,T,A C G G C,DNA:RNA 5 A T G C G T A,3,U,A C G C A U,RNA:RNA 5 A U G C U A C G,3,U,A C G A U G C,（,2,）一般流程,载片的处理,(,除脂，灭菌，去除核酸酶污染,),组织细胞切片或涂片的固定,（甲醛、多聚甲醛、乙醇,+,冰乙酸）,组织细胞杂交前的预处理（,去污、蛋白酶酶解,）,探针的标记,(,前述方法,),杂交液的配制,一,杂交,冲洗,放射自显影或免疫酶法显色,显示杂交结果,（,3,）注意事项,2,、菌落原位杂交（,colony hybridization,）,（1,）基本原理,菌落原位杂交,是指首先将生长在培养基平板上的菌落按照其原来的位置不变地转移到,滤膜,上，然后在滤膜上进行,原位溶菌,、,DNA,变性,、,杂交,，并实行检测的方法,（,2,）菌落原位杂交（,colony hybridization,）流程,该法可从大量细菌中筛选含特异的,DNA,序列及基因工程重组体。,菌落原位杂交示意图,3,、斑点狭缝杂交（,dot and slot blotting,）,（,1,）基本原理,斑点狭缝杂交,是指将,RNA,或,DNA,变性,后直接以形成,斑点或狭缝的装置,点样于,硝酸纤维素滤膜,上，与标记的,核酸探针,进行,杂交,并对其实行检测的方法,（,2一般流程,(,手工点样斑点杂交,),制备核酸样品,将核酸样品进行变性处理,利用微量加样器直接点样于干燥的硝酸纤维素滤膜上,与,标记的核酸探针进行杂交,放射自显影,或,免疫酶法显色,显示,杂交结果,（,3,）特点,方法简单、迅速，适合于核算样品的定性检测,4,、膜上吸印杂交,（,1,）基本原理,膜上吸印杂交,是将待测,核酸序列片段,通过,吸印技术,转移结合到一定的,固相支持物,上，然后与存在于,液相中标记的核酸探针,进行,杂交,并对其实行检测的方法,（,2,）固相支持物,硝酸纤维素滤膜,(nitrocellulose filter membrane),尼龙膜,(nylon membrane)3,）吸印方法,虹吸转移法,电泳转移法,真空转移法,（,4,）核酸膜上吸印杂交的主要类型,Southern,吸印杂交法,DNA,又叫做,萨瑟恩,DNA,印迹杂交,，它是由,E.Southern,于,1975,年首先设计出来的,A,基本原理,Southern,吸印杂交法,(Southern blot),是通过虹吸转移法、电泳转移法、真空转移法等转移方法将经电泳分离及变性的,DNA,片段,转移到一定,固相支持物,（滤膜）上，然后进行,杂交,并对其实行检测的方法。,带有,DNA,片段的凝胶,DNA,分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上,转膜,杂交、显影,凝胶,滤膜,用缓冲液转移,DNA,吸附有,DNA,片段的膜,B.Southern,印迹杂交的技术流程,（a）,（b）,（c）,（d）,（e）,基因组,DNA,DNA,限制片段,硝酸纤维素滤膜,同探针同源杂交的基因,DNA,片段,X,光底片,Southern,凝胶转移杂交技术,Southern DNA,印迹杂交之,X,光显像图片,水稻（,Oryza,sativa L,.),的叶绿体,DNA,分别用核酸内切限制酶,Bgl,(A,-C),、,BamH,（,D-F,）、,EcoR,（,G-I,）、和,Hind,（,J-L,）,消化，加样在含有,EtBr,染料的,1%,的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32,P,标记的玉米,psbA,探针作,Southern,杂交。,X,光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的,psbA,基因序列。,Northern,吸印杂交法,RNA,又叫,诺赛恩,RNA,印迹技术,，,1979,年由,J.C.,Alwine,等人发展而来，由于这种方法与,萨瑟恩,DNA,印迹杂交技术十分类似,，所以叫做,诺赛恩,RNA,印迹技术,（,Northern blot,）,A,基本原理,Northern,吸印杂交法,(Northern blot),是通过虹吸转移法、电泳转移法、真空转移法等转移方法将经,变性及电泳分离的,RNA,转移到一定,固相支持物,（虑膜）上，然后进行杂交并对其实行检测的方法,B.,一般流程,提取,RNA,样本,RNA,变性琼脂糖凝胶电泳分离转移至膜探针（标记,DNA,或,RNA,）与之杂交显影或显色检测信号,Northern,吸印杂交法,（,Nor,thern blotting,）,电泳变性,检测杂交信号,提取,RNA,