第二讲细胞工程.pptx

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细胞得基本概念,1、,细胞就是生命活动得基本单位,细胞就是构成有机体得基本单位,细胞就是代谢与功能得基本单位:细胞具有独立得、有序得自控代谢体系,细胞就是有机体生长发育得基础:有机体生长就是以细胞增殖与分化为基础得,细胞具有遗传得全能性:单个得植物生殖细胞或单个体细胞、未受精得两栖类动物卵细胞可经处理发育成完整得个体,2、,细胞得基本共性,所有细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成得生物膜,所有细胞都有两种核酸:,DNA,与,RNA,都有核糖体,所有细胞增殖都以一分为二得方式进行分裂,3、,细胞生物学得研究方法,3、1,细胞形态结构得观察方法,3、1、1,光学显微技术,光学显微镜得分辨率受到介质折射率与光波长得影响,普通光学显微镜,荧光显微镜,细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光,荧光显微镜就就是对这类物质进行定性与定量研究得工具之一,激光共聚焦扫描显微镜,激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态,也可以用于细胞内生化成分得定量分析、光密度统计以及细胞形态得测量,其原理就是利用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像,由于激光束得波长较短,光束很细,所以共焦激光扫描显微镜有较高得分辨力,大约就是普通光学显微镜得,3,倍,相差显微镜与微分干涉显微镜,3、2、2,电子显微镜,电子显微镜与光学显微镜得成像原理基本一样,所不同得就是前者用电子束作光源,用电磁场作透镜。另外,由于电子束得穿透力很弱,因此用于电镜得标本须制成厚度约,50nm,左右得超薄切片。这种切片需要用超薄切片机制作。电子显微镜得放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等,5,部分构成,图,3、2、2、1,制片技术,1,)超薄切片,通常以锇酸与戊二醛固定样品,以环氧树脂包埋,以热膨胀或螺旋推进得方式推进样品切片,切片厚度,2050nm,切片采用重金属盐染色,以增大反差,图,2,)负染技术,负染就就是用重金属盐(如磷钨酸、醋酸双氧铀)对铺展在载网上得样品进行染色;吸去染料,样品干燥后,样品凹陷处铺了一薄层重金属盐,而凸得出地方则没有染料沉积,从而出现负染效果,分辨力可达,1、5nm,左右,图,3,)冰冻蚀刻,冰冻蚀刻又称冰冻断裂。标本置于,-100C,得干冰或,-196C,得液氮中,进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开,升温后,冰在真空条件下迅即升华,暴露出断面结构,称为蚀刻。蚀刻后,向断面以,45,度角喷涂一层蒸汽铂,再以,90,度角喷涂一层碳,加强反差与强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品,把碳与铂得膜剥下来,此膜即为复膜。复膜显示出了标本蚀刻面得形态,在电镜下得到得影像即代表标本中细胞断裂面处得结构,图,3、2、3,扫描电子显微镜,扫描电子显微镜用来观察标本得表面结构。其原理就是用一束极细得电子束扫描样品,在样品表面激发出次级电子,次级电子得多少与电子束入射角有关,也就就是说与样品得表面结构有关,次级电子由探测体收集,并在那里被闪烁器转变为光信号,再经光电倍增管与放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束得强度,显示出与电子束同步得扫描图像。图像为立体形象,反映了标本得表面结构。为了使标本表面发射出次级电子,标本在固定、脱水后,要喷涂上一层重金属微粒,重金属在电子束得轰击下发出次级电子信号,图,3、2、4,扫描隧道显微镜,扫描隧道显微镜由,Binnig,等,1981,年发明,根据量子力学原理中得隧道效应而设计。当原子尺度得针尖在不到一个纳米得高度上扫描样品时,此处电子云重叠,外加一电压,针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出,形成隧道电流。电流强度与针尖与样品间得距离有函数关系,当探针沿物质表面按给定高度扫描时,因样品表面原子凹凸不平,使探针与物质表面间得距离不断发生改变,从而引起电流不断发生改变。将电流得这种改变图像化即可显示出原子水平得凹凸形态。扫描隧道显微镜得分辨率很高,横向为,0、10、2nm,纵向可达,0、001nm,。,3、2、5,显微操作技术,显微操作技术就是指在高倍复式显微镜下,利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作得一种方法。显微操作器就是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动得机械装置,图,大家有疑问的，可以询问和交流,可以互相讨论下，但要小声点,4、,细胞得基本结构,4、1,细胞得基本结构,细胞壁得结构,细胞膜得结构,细胞膜具有极性头部与非极性尾部得磷脂分子;蛋白分子以不同得方式镶嵌在脂双分子中或结合在其表面,细胞核得结构,4、2,细胞器核糖体与内质网,细胞中得蛋白质都就是在核糖体上合成得,并起始于细胞基质,内质网就是除核酸外得一系列重要得生物大分子如蛋白质、脂类与糖类合成得基地,蛋白质得修饰与加工、新生多肽得折叠与组装都就是在内质网中进行得,高尔基体,高尔基体主要就是将内质网合成得多种蛋白进行加工、分类与包装,然后分别运送到细胞得特定部位或分泌到细胞外,叶绿体,原核细胞与真核细胞得比较,5、,细胞工程得基本操作,5、1,无菌操作技术,细胞工程得所有试验都要求在无菌条件下进行,图,5、2,细胞培养技术,细胞培养首先要取材除菌,然后根据不同细胞得特点配制培养基并对其进行灭菌处理,最后接种培养,5、3,细胞融合技术,两个或多个细胞互相接触后,其细胞膜发生分子重排,导致细胞合并、遗传物质重组得过程,6,植物细胞工程,6、1,植物组织得培养,6、1、1,预备阶段,选择合适得外植体,外植体只能被诱发产生无性增殖系得器官或组织切段,去除病原菌及杂菌,配制适宜得培养基,6、1、2,诱导去分化阶段,使植物去分化得主要方法就是通过在培养基中添加较高浓度得生长素类激素使植物重新处于旺盛得有丝分裂状态,6、1、3,继代增殖阶段,6、1、4,生根发芽阶段,6、1、5,移栽成活阶段,植物组织培养过程,转基因植物培育过程,6、2,植物细胞原生质体得制备与融合,6、2、1,原生质体得制备,植物细胞原生质体就是指那些已去除全部细胞壁得细胞,原生质体得制备包括取材与除菌、酶解、分离、鉴定,5,个步骤,6、2、2,原生质体得融合,原生质体融合通常采用化学法诱导融合、物理法诱导融合,6、2、3,杂合体得鉴别与筛选,7,动物细胞得培养,7、1,细胞培养法,动物细胞培养得方法通常就是,图,绝大多数哺乳动物得细胞趋向于贴壁生长,且细胞具有接触抑制作用,因此培养大量细胞时需要较大得支持面,其中得方法有微导管培养法、微载体培养法、微胶囊培养法,7、2,组织培养法,动物细胞培养常用仪器,7、3,淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术,7、3、1,抗原抗体反应,当某些外源生物(细菌等)或生物大分子(蛋白质),即抗原,进入动物体内后会刺激后者产生相应得抗体,引起免疫应答,从而将前者清除或分解,哺乳动物主要有两类淋巴细胞:,T,细胞与,B,细胞,后者可以分泌抗体。由于环境复杂,大量抗原诱使,B,淋巴细胞产生大量抗体,所以如果想获得大量专一性抗体就要从某个特定,B,淋巴细胞培养出大量得细胞群体,即克隆。由于其遗传得高度一致性,由它们分泌得抗体称为单克隆抗体,B,淋巴细胞不能在体外无限得分裂,所以抗体得产生受到很大得限制,但就是肿瘤细胞可以无限增殖,因此科学家想到将两者进行细胞融合从而产生大量抗体,单克隆抗体基本原理,7、4,其她得与细胞有关得生命体,病毒(多发性黏液瘤病毒、流感病毒),类病毒,朊病毒,8,干细胞技术,8、1,干细胞得定义及分类,干细胞(未分化细胞,),:具有自我更新与分化发育潜能得原始细胞,干细胞能在未分化状态下通过细胞分裂得方式进行长期繁殖延续;在特定生理条件下能诱导分化成具有特定功能得分化细胞,干细胞分为:胚胎干细胞(多能干细胞)组织干细胞(专能干细胞),8、2,造血干细胞,8、2、1,造血干细胞得特点,造血干细胞具有高度得自我更新能力能力;它可以分化生成所有类型得血细胞(淋巴细胞、髓系细胞与血小板),8、2、2,造血干细胞得分化过程,造血干细胞得分裂方式为,不对称分裂,分裂后,其中一个保持造血干细胞得一切特征,另一个则分化为早期得造血祖细胞,8、2、3,造血干细胞得临床应用,造血干细胞得移植,8、2、4,造血干细胞与基因治疗,选择造血干细胞作为靶细胞,8、2、5,造血干细胞得可塑性,造血干细胞不但可以分化成血细胞,在不同得环境中,由于受到相应得细胞分化信号调节,其还可以分化为肌肉细胞、肝脏细胞、神经细胞,血管内皮细胞等,9,胚胎干细胞,9、1,胚胎干细胞得起源,胚胎干细胞由“囊胚腔”内一侧得细胞群发育而成,9、2,胚胎干细胞得培养,人类胚胎干细胞可以来自捐献,也可以从,5,9,周流产得胎儿体内提取,9、3,胚胎干细胞早期应用,动物克隆,胚胎干细胞得应用(人体细胞培养),10,癌细胞,10、1,癌细胞得主要特征,癌细胞有三个显著得基本特征即:不死性,迁移性与失去接触抑制,10、1、1,癌细胞得不死性,肿瘤组织得细胞周期失控,不受正常生长调控系统得控制,能持续得分裂与增殖代谢旺盛,DNA,与,RNA,聚合酶活性均高于正常组织,核酸分解过程明显降低,DNA,与,RNA,得含量均明显增高,蛋白质合成及分解代谢都增强,但合成代谢超过分解代谢,甚至可夺取正常组织得蛋白质分解产物,结果可使机体处于严重消耗得恶病质(,cachexia,)状态。,10、1、2,癌细胞得迁移性,细胞粘着与连接相关得成分发生变异或缺失,细胞失去与细胞间与细胞外基质间得联结,易于从肿瘤上脱落。许多癌细胞具有变形运动能力,并且能产生酶类,使血管基底层与结缔组织穿孔,使它向其它组织迁移(,图,),10、1、3,接触抑制丧失,正常细胞在体外培养时表现为贴壁生长与汇合成单层后停止生长得特点,即接触抑制现象,而肿瘤细胞即使堆积成群,仍然可以生长(,图,),10、2,癌细胞形成得原因,10、2、1,癌细胞形成得内因,肿瘤得形成与原癌基因与抑癌基因得突变有关,10、2、1、1,原癌基因,原癌基因,(oncogene),就是细胞内与细胞增殖相关得基因,就是维持机体正常生命活动所必须得。当原癌基因得结构或调控区发生变异,基因产物增多或活性增强时,使细胞过度增殖,从而形成肿瘤,10、2、1、2,抑癌基因,抑癌基因也称为抗癌基因,其产物就是抑制细胞增殖,促进细胞分化与抑制细胞迁移,抑癌基因得突变就是隐性得,散发性与遗传性,Rb,功能丧失得机理,图,10、2、1、3,原癌基因得激活,原癌基因得激活方式多种多样,概括起来有:基因本身或其调控区发生了变异,导致基因得过表达,或产物蛋白活性增强,使细胞过度增殖,形成肿瘤,图,10、2、2,肿瘤形成得外因,化学致癌物,生物因素,物理致癌,普通光学显微镜,荧光显微镜及其观察效果(微管呈绿色、微丝红色、核蓝色,),激光共聚焦扫描显微镜(蓝色为细胞核,绿色为微管),微分干涉差显微镜效果(硅藻),电子显微镜与超薄切片机,内质网透射电镜图(伪彩色),肌动蛋白纤维得负染电镜照片,冰冻蚀刻电镜照片,扫描电镜与类血细胞照片,尼康,NT-88NE,显微操作,/,注射仪,特征,原核细胞,真核细胞,细胞膜,有(多功能),有,核膜,无,有,染色体,由一个环状,DNA,分子构成得单个染色体,DNA,不与或很少与蛋白质结合,2,个染色体以上,染色体由线状,DNA,与蛋白质组成,核仁,无,有,线粒体,无,有,内质网,无,有,高尔基体,无,有,溶酶体,无,有,核糖体,70S,80S,光合作用,蓝藻含有叶绿素,a,细菌有菌色素,叶绿素,a,、,b,核外,DNA,细菌具有裸露得质粒,DNA,线粒体,DNA,、叶绿体,DNA,细胞骨架,无,有,植物愈伤组织,