体外诊断试剂临床研究讲义.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,体外诊断试剂的临床研究,体外诊断试剂的种类,化学或生化检测试剂,免疫学检测试剂,抗原检测,抗体检测,核酸检测试剂,核酸杂交技术,核酸扩增技术,其他试剂,核酸扩增技术,目的片段的扩增,聚合酶链反应（,PCR,）,以转录为基础的扩增技术（,TAS,）,链取代的扩增技术（,SDA,）,探针的扩增,连接扩增反应（,LAR,）,以,FEN-1 DNA,聚合酶为基础的扩增,循环探针,信号扩增,免疫检测的原理,直接法,间接法,免疫反应中按标记物分类,同位素标记的放射免疫法,酶标记的酶联免疫法,生物素标记,化学发光物质标记的化学发光法,荧光素标记,时间分辨法,其他标记物,临床研究的意义以及目的,临床前样品虽有代表性，但数量毕竟有限并不能完全代表临床情况,通过临床试验对临床前制定的各项指标进行修正,可以发现或预测在实际应用中遇到的问题，在说明书中提醒用户注意,临床研究的基本要求,伦理考虑,一般样品,特殊样品,对研究对象保密,临床前研究结果,对临床研究单位以及人员的要求,从事相应的工作,具有相应的技术人员,有相应的仪器设备,如果试剂对仪器无特殊要求，则应选择不同品牌或不同型号,有不同专业人员参加,至少两家省级单位,对实施实验单位的能力进行评价,指综合能力包括检测能力、仪器设备和人员等,主要检测盲样，符合要求这方能参与,对照方法或试剂的要求,新诊断试剂,疾病症状以及临床诊断,相关试剂,研究对象的追踪随访,疾病的判断标准,已有同类产品的试剂,可选择同类试剂,;,若评价试剂所用的原料为基因工程产品，应用非基因工程 原料制备的试剂进行评价；对结果不一致样品的处理,临床样品的选择,人群,:,根据试剂的适应症选择不同的人群,样品,:,应为自然人群，尚未用同类试剂进行筛查过,选择不同地区,:,代表被测物的不同流行率，代表被测物的不同基因型或血清型,疾病的时期,:,样品的数量,:,检测方法,盲法平行检测,结果不一致样品的进一步分析,诊断试剂的临床评价指标,灵敏度（,Sensitivity,）：,在阳性样品中检出阳性样品的百分比,特异性（,Specificity,）：,在阴性样品中检出阴性样品的百分比,样品分布,(,eg,.STDEV;,),Suitability of cut-off,阴性预期值,(NPV),：,若样品没有反应，则不含检测物的可能性,阳性预期值,(PPV),：,若样品有反应，则含检测物体的可能性,重复性（,Reproducibility,）,准确性（,Accuracy,),精确性,(,Precision,）,灵敏度,定义,：试剂的检测限度,方法,：检测一定数量的阴性样品，计算均值和标准差,均值和标准差，临界值等于均值加上2个标准差,意义,：在临界值以上的样品有95%为真阳性,临界值的评估,：检测一系列正常人群、非正常人群和特殊人群对临界值进行核对,表示方法：,以量值表示（如,ng,，单位，,CFU/ml,，,PFU/ml,，拷贝数等）；以稀释度表示,影响灵敏度的因素,特殊疾病,有一些特殊的病人，其代谢异常可能影响标志物的检测,干扰物质或抑制物质,可以来自与病人（药物）；也可来自于样品的处理过程（反复冻融，溶血等）；或样品本身存在抑制物等,样品基因型和血清型的影响,有些被测物存在多种基因型或血清型，若原材料没有广谱性，则可影响灵敏度,试剂的灰区：,对特殊的试剂要制定灰区，如,FDA,要求,HCV,抗体试剂临界值以上均为灰区，对灰区样品要加倍重试,核酸检测抑制物的作用原理,核酸扩增需要酶的参与,酶发挥作用需要辅助因子以及特殊的条件,辅助因子与酶的特殊部位物理结合后发生反应,任何结合辅助因子、改变环境或阻止酶与辅助因子特异结合的物质均抑制反应,核酸扩增常见的抑制物,血红素及其代谢物影响,DNA,聚合酶的反应，不同来源的,DNA,聚合酶受影响程度不同,痰中的酸性多聚糖或糖蛋白均影响,DNA,聚合酶的反应,脑脊液和尿中可能含有抑制物，但具体物质不明确,粪便中的胆汁盐是,PCR,反应的强抑制剂,肝素可与,DNA,聚合酶结合，对不同的酶抑制程度不同,核酸提取试剂中的某些物质具有抑制作用：,EDTA,，,SDS,，盐酸胍等,内标的种类,未修饰性的内标,异源性内标,修饰性的内标,特异性定义：主要指假阳性的检出情况,评价方法：主要是通过检测部分样品，或特殊样品尤其是性质相近的标志物（如不同基因型或血清型样品），分析出现假阳性的情况；而且分析时要注意在不同量时的特异性,造成非特异性的因素,原料,：主要纯度不够，原料本身存在非特异反应,物质,反应模式,：如孵育时间缩短非特异反应可提高,3-4倍，非常短时可高达10倍,样品中的干扰物质,：,病人本身：如自身免疫性疾病（高免疫球蛋白血症等），黄疸类、溶血类和高脂类病人,病人使用特殊药物,样品处理过程：如不同抗凝剂，不同试管，某些 化学或去污剂以及样品反复冻融等因素,核酸检测中造成非特异性的因素,交叉反应：,主要是引物序列与被测物中序列存在一定程度的同源性,样品之间的污染：,气溶胶中含有目的微生物，对照的污染等,扩增产物的污染：,扩增产物聚集在器皿、台面、设备以及通风设施上等造成污染,污染的处理,酶的灭活（,UNG,）,主要用于灭活产物,光化学处理,用可溶性,psoralen,的衍生物处理，在用长紫外照射 即可灭活产物、也可减少样品的污染,化学处理方法,用于表面的处理,10%,次氯酸钠,紫外照射,物理的:,专用移液器、一次性试管架、紫外灯、,PCR,工作罩、滤芯吸嘴,。,样品典型的正态分布,Negative,population,Positive,population,Frequency of observations,0100,1,10,Percentage of maximum signal(log),Cut-off,特异性与,值关系的分析,企业,假阳性,特异性（,%,）,值,金豪,万泰,GBI,耀华,科华,丽珠,华美,新创,普生,绿科,中山,理利,Murex,梅里埃,3,2,5,1,0,3,2,7,15,1,8,22,11,4,99.70,99.80,99.49,99.90,100,99.70,99.80,99.29,98.48,99.90,99.19,97.77,98.88,99.59,-3.985,-3.688,-3.423,-3.364,-3.687,-2.741,-4.337,-3.636,-2261,-3.060,-2.778,-1.774,-3.551,-4.311,样品库有,985,份样品。特异性与其“,”,值相关性系数为,0.691,具有显著的统计学意义,(P=0.004,）,d-d+,值的计算以及意义,delta=d/SD,cut-off,log,10,OD/CO,X,X,0,Frequency,OD/CO data must be transformed to log,10,values before the,analysis,数值的计算,样品的实际状态,+-,+,检测结果,-,A B,C D,A+B,C+D,A+C B+D,灵敏度,=A/,（,A+C);,特异性,=D/,（,B+D,）,阳性预期值,:1),简单的计算方法即：,PPV=A/,（,A+B,）可以给出一个大约的数值,;,2),精确的计算方法即：,PPV=,流行率,敏感性,/,流行率,敏感性,+,（,1-,流,行率）,（,1-,特异性,),阴性预期值,:1),简单的计算方法即：,NPV=D/,（,C+D,）可以给出一个大约的数值,2),精确的计算方法即：,NPV=(1-,流行率）,特异性,/,（,1-,流行率）,特异性,+,流行率,（,1-,敏感性,),精确性(,Precision),作用：评价试剂的随机误差,通过重复检测某一或某些特定样品并分析其一致性，通常以变异系数或相对标准误来表示,样品的要求：最好应含有高、中、低三类,每一类样品至少检测4次，实际上检测10次或10次以上,准确性（,accuracy),主要评价试剂的系统误差，反映样品的检测值和真实值的一致性,表示方法：,偏差（%）=（检测值-真实值）,X100/,真实值,评价方法：,1,.,在某一样品中加上已知量的检测物重复检测，计算检测值与预期值的偏差,2,.,检测已知量的参考品，计算检测量与标化量的偏差,定量范围,定义：能够给出准确量值的范围,建立的方法：主要对系列稀释样品的反复检测,制定的,定量曲线：线性或非线性,要求：对定量范围的上限和下限样品进行检测,时，其精确性仍能符合要求,重复性（,Reproducibility）,不同实验次数之间,（,Run-run）,不同实验室之间（,Site-site）,不同实验人员之间（,Operator-operator）,不同时间之间（,Day-day）,特殊情况下的重复性,定量试剂的特殊要求,样品所含被测物的量应该分散,应含有在最高和最低检测限的样品,与参比试剂的检测结果计算相关性，,而且要统计两种检测结果的量值有无统计学差异,谢谢,