第五章DNA生物合成.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第五章,DNA,的生物合成,第一节 原核生物的,DNA,复制,第二节 真核生物的,DNA,复制,第三节,DNA,的损伤修复,第四节,DNA,的重组,DNA,具有储存、传递（包括复制、转录、翻译）和接受（反转录）遗传信息的功能。,DNA,的生物合成包括,DNA,的复制、损伤修复和重组。,DNA,复制是保持,DNA,分子的忠实拷贝过程，具有高度的忠实性，,DNA,修复和重组是影响遗传信息本身结构的调整过程，保持遗传信息的完整性。,第一节 原核生物的,DNA,复制,复制（,replication,）是以亲代的,DNA,为模板合成出相同,DNA,分子的过程，也是遗传信息从亲代向子代的传递过程，因此与细胞的增殖有关。,染色体外的遗传因子，包括细菌的质粒、真核生物的细胞器及细胞内共生生物的,DNA,。它们的复制方式或受染色体复制的控制，与染色体复制同步；或不受染色体复制的控制，在细胞周期中随时都可以进行。,如果病毒,DNA,整合到宿主染色体中，则该,DNA,作为宿主染色体的一部分而被复制。,一,.DNA,的半保留复制,（一）概念,DNA,生物合成时，母链,DNA,解开为两股单链，各自作为模板,(template),按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。,子代细胞的,DNA,，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的,DNA,都和亲代,DNA,碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制,亲代,第一代,第二代,（二）半保留复制的实验证据,1958,年,Meselson,和,Stahl,用同位素,15,N,标记大肠杆菌,DNA,，首先证明了,DNA,的半保留复制。,重,轻,杂和,DNA,杂和,DNA,新链,旧链,（三）,DNA,的半保留复制的生物学意义：,按半保留复制方式，子代,DNA,与亲代,DNA,的,碱基序列一致,，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的,保守性,.,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但,不是绝对的,。,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式 半保留式 混合式,（四）,复制的起点和方向,1.,概念,复制子,(replicon),：,基因组能,独立进行复制的单位。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个,复制子,.,起点,(origin),：也称原点，,控制复制起始，是含有,100,200,个碱基对的一段,DNA,。细胞内存在着能识别起点的特殊蛋白质,(,大肠杆菌中称为,Dna A,蛋白,),。,终点,(terminus),：,终止复制的序列位点,.,复制叉,(replication fork),：复制开始后由于,DNA,双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构。,A.,环状双链,DNA,及复制起始点,B.,复制中的两个复制叉,C.,复制接近终止点,(termination,ter),ori,ter,A B C,原核生物：,只有一个复制子,真核生物：,多个复制子，多个起点，形成多个,“复制眼”或“复制泡”,5,3,ori,ori,ori,ori,5,3,5,5,3,3,5,5,3,复制子,3,2.,起始点和方向,1,）原核生物和真核生物复制都是在,DNA,分子特定的位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的保守顺序,GATC,和,TTATCCACA,，多次出现，可被酶识别。,2,）方向：大多是双向、对称复制,也有单向或不对称的。,3,）速度：原核复制叉移动快,(,约,1000,个核苷酸/s,);,真核生物复制叉移动慢,(,约,50,个核苷酸,/s,),。典型动物细胞所含,DNA,是细菌中的,50,倍左右，但两者,DNA,的复制时间差异不很大（大肠杆菌,40min,，真核通常几小时），因为真核生物为多复制子。,复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）,二,.,DNA,聚合酶,(DNA polymerase,DNA-pol,),(,一,)DNA,聚合酶的反应特点,DNA,聚合酶是一种催化依赖模板的以脱氧核苷三磷酸为前体合成,DNA,的酶。,1956,年,Arthur kornberg,等首先从大肠杆菌,中发现,DNA,聚合酶，其后在不同的生物中都找,到有这种酶。,DNA,聚合酶的反应特点：,4,种,dNTP,底物：,(dATP dGTP dCTP dTTP),；,接受模板指导,:,解开成单链的,DNA,母链；,需引物提供,3,-OH,；,新链生长方向：,53,；,产物,DNA,性质,与模板相同。,此外,DNA,复制过程中还需其它酶和蛋白质因子,.,模板,DNA,链,引 物,新加入的,dNTP,脱氧核糖,亲核攻击,5,3,生长的,DNA,链,*,引物,(primer),是一和模板链互补的线性片段,其上带有能与核苷酸相结合的游离,3-OH.,引物通常是寡聚,RNA.,（二）大肠杆菌,DNA,聚合酶,有五种，即,DNA,聚合酶,、,、,、,和,。,1.,大肠杆菌,DNA,聚合酶,pol,也称,Kornberg,酶,是各种,DNA,聚合酶中研究的最透彻的，它的一些特点代表了,DNA,聚合酶的基本特点：,1,）,pol,的性质,分子量：,103 000,，单链，球形，活性部位含,Zn,2,每个细胞有,400,个酶分子。,323,个氨基酸,小片段,5,核酸外切酶活性,大片段,/Klenow,片段,604,个氨基酸,DNA,聚合酶活性,5,核酸外切酶活性,N,端,C,端,木瓜蛋白酶,DNA-pol ,Klenow,片段是实验室合成,DNA,，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,模 板,聚合酶活性位点,引物,3 5,外切酶位点,2,）功能：,5,3,聚合酶活性（大片段上酶与模板结合后构象改变，识别碱基，正确配对后才发挥聚合作用；（错误率,10,-5,）,3,5,外切酶活性（大片段上）；,仅对短的单链,DNA,起作用，主要是对新生,DNA,链进行校对，防止“错配”；,（错误率,5*10,-2,）,53,外切酶活性（小片段上）。,仅作用于双链,DNA,，可切除由紫外线照射形成的嘧啶二聚体，也可切除冈崎片段,5,端,RNA,引物。,2,）功能：,53,聚合酶的选择作用和,3,5,外切酶的校对作用使,DNA,复制过程受到双重核对，大大减少了错误率。,可见，,DNA pol,是,1,个多功能酶。但它不是,DNA,合成的主要酶，持续合成能力（指,DNA,聚合酶解离前所能加上的核苷酸的平均数目）较低。,故其功能主要是：对复制中的错误进行校读，对,DNA,损伤进行修复，以及在,DNA,复制时,RNA,引物的切除及其空隙的填补。,2.,大肠杆菌,DNA,聚合酶,pol,1,）,多亚基，聚合酶亚基,(,单链,),分子量为,88 000,每个细胞有,100,个酶分子,2,）功能：,5,3,聚合酶活性；,35,外切酶活性。,（,该酶无,53,外切酶活性,;,且活性低，表明该酶仍不是主要的复制酶，可能是一种修复酶。一般在无,DNA,聚合酶,和酶,时，该酶才起作用，具体功能仍不清楚）,目前认为该酶主要参与,DNA,损伤的修复。,3.,大肠杆菌,DNA,聚合酶,pol,真正的,DNA,复制酶，,1971,年发现,1,）,pol ,是真正起复制作用的酶,，,由10种亚基组成,不对称二聚体,含,Zn,2+,，,、,、,组成核心酶,2,）功能：,5,3,聚合酶活性（,亚基）；,35,外切酶活性（,亚基）。,该酶在原核细胞中主要负责,DNA,链的延伸，是,复制延长中真正起催化作用的酶。,(,该酶,无,53,外切酶活性,),E.coli,DNA,聚合酶,不对称二聚体,可滑动的 夹持器亚基,催化亚基,3,5,外切酶亚基,前导链 合成,后随链 合成,夹持器装置,催化亚基,亚基保持核心酶 的二聚体结构,酶的各个亚基的作用见表,5-1.,亚基具有,53,方向合成,DNA,的催化活性,亚基具有,35,外切酶活性，起校对功能，,可提高聚合酶,复制,DNA,的保真性,亚基可能,起组建的作用,亚基犹如夹子，,功能是识别引物、夹住,DNA,分子向前滑动,亚基,起着促使核心酶二聚化的作用,其余的亚基构成,-,复合物，,主要功能是帮助,亚基夹住,DNA,（也称夹子装置器），并有,增强核心酶活性的作用,DNA,聚合酶,pol pol pol,亚基数目,1,4,10,5,3,聚合酶活性,+,3,5,外切酶活性,+,5,3,外切酶活性,+,-,-,聚合速度,(,核苷酸,/,分,),1 0001 200 2 400 15 000-60 000,持续合成能力,3200 1 500 500 000,分子数,/,细胞,400 100 1020,功能,切除引物,修复 修复 复制,表 大肠杆菌,3,种,DNA,聚合酶性质比较,4,）,大肠杆菌,DNA,聚合酶,和,1999,年发现,DNA,聚合酶,和,，参与,DNA,的错误倾向修复。,当,DNA,受到严重损伤时，正常的,DNA,聚合酶在该处不能形成正确的碱基配对而停止修复，此时诱导产生这两种酶，能在损伤部位继续复制，但修复的准确性较差，会造成较高的突变率，这虽然会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变的细胞得以存活，从而延续种系。,（三）与,DNA,的复制过程有关的其他酶和蛋白质因子,（以大肠杆菌为例）,除,DNA,聚合酶外还需要,20,多种不同的酶和蛋白质因子的参与，整个复合物统称为,DNA,复制酶系统,(DNA replicase system),或者复制体,(replisome),。,解旋酶,（,helicase,）：,DNA,复制时，解旋酶沿着,DNA,母链滑动使之解旋，同时打开双链之间的氢键，这一过程所消耗的化学能通过,ATP,水解提供。,（三）与,DNA,的复制过程有关的其他酶和蛋白质因子,（以大肠杆菌为例）,拓扑异构酶,（,topoisomerase,）：用于消除螺旋状,DNA,解旋时产生的拓扑应力。拓扑异构酶,I,主要集中在活性转录区，与转录有关；拓扑异构酶,II,分布在染色质骨架蛋白和核基质部位，同复制有关。,单链,DNA,结合蛋白,（,single strand DNA binding protein,SSB,）,引物酶,（,primase,）：促使引物合成。,DNA,连接酶,（,DNA ligase,）,可分为三个阶段：合成的,起始，延伸，终止,。,（一）起始（以大肠杆菌为例，图,5-9,）,至少有,9,种酶或蛋白质参与复制的起始。,起始位点是,245bp,构成的高度保守序列，有两个关键序列，一个由,13bp,组成的,3,次重复片段和一个由,9bp,组成的,4,次重复片段。,合成起始阶段的关键部分是,DnaA,蛋白（只与负超螺旋的,DNA,相结合）。,原核生物的,SSB,与,DNA,的结合有明显的协同效应。,三、双链,DNA,复制的分子机制,图,5-9.,大肠杆菌起始点,oriC,的复制引发模型,A.,约,20,个各带,1,个,ATP,的,DnaA,蛋白 结合于,9bp,序列，使,DNA,围 绕着复合物卷成一圈,B.,三个富含,A=T,的,13bp,重复序列被变性,C.,在,DnaC,蛋白 的帮助 下,DnaB,蛋白进一步 使,DNA,解螺旋，以 备引物和,DNA,的合成,3,组,13,个碱,基对重复,DnaA,+ATP,4,组,9,个碱,基对重复,oriC,HU+,ATP,DnaB,DnaC,+ATP,DnaB,解旋酶,引发与复制,A,C,B,表,5-3,大肠杆菌复制起始点引发,DNA,复制所需的蛋白质,蛋白质,亚基数,功能,DnaA,蛋白质,1,识别起始点序列，在起始点特异部位解开起始点双链,DnaB,蛋白质（解旋酶）,6,使,DNA,解旋，解开,DNA,双链,DnaC,蛋白质,1,帮助,DnaB,结合在起点,HU,2,类组蛋白；使,DNA,弯曲，刺激复制的引发,引物酶（,DnaG,蛋白质）,1,合成,RNA,引物,单链,DNA,结合蛋白质（,SSB,）,4,结合单链,DNA,RNA,聚合酶,5,有利于提高,DnaA,的活性,DNA,旋转酶（,DNA,拓扑异构酶,）,4,消除因,DNA,解旋而产生的应力,Dam,甲基化酶,1,使,ori,C,处（,5GATC,序列甲基化,（二）延伸,DNA,的两条链都能作为模板。,由于,DNA,分子的一条链的走向为,35,，另一条链为,53,；而所有已知,DNA,聚合酶的合成方向都是,53,。,为了解决这个矛盾，,1968,年，日本学者,Okazaki,等提出了,DNA,的不连续复制模型，认为：,沿,35,模板链合成的子链是连续合成，而沿,53,方向合成的子链是分段合成，由许多,DNA,片段连接起来的。,1,、冈崎片段和半不连续复制,以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链是,35,走向，在其上,DNA,能以,53,方向连续合成，称为,前导链,（,leading strand,）；,另一条模板链是,53,走向，在其上,DNA,也是从,53,方向合成，但是与复制叉移动的方向正好相反，所以随着复制叉的移动，形成许多不连续的片段，最后连成一条完整的,DNA,链，该链成为,滞后链或后随链,（,lagging strand,）。,冈崎片段,(Okazaki fragment),：,在不连续的后随链,DNA,合成中形成的,DNA,短片段,，在原核生物为,1000,2000,核苷酸，真核生物约,100,200,核苷酸。,1968,年冈崎发现。,DNA,的半不连续复制,:,DNA,双链复制时，一条链是连续合成的,(,前导链,leading strand,),，另一条链是不连续合成的,(,滞后链或后随链,lagging strand),，这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制方式称,DNA,的半不连续复制。,3,5,3,5,3,5,3,5,解链方向,领头链,(leading strand),后随链,(lagging strand),DNA,的半不连续复制,3,5,复制叉,起点,复制叉,延伸,延伸,起点,领头链,领头链,随后链,随后链,3,5,3,5,DNA,的双向复制,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,2,、,DNA,半不连续复制中的,RNA,引物,（,1,）前导链和滞后链的合成都需要,RNA,引物。,（,2,）引物合成酶,(Dna G),：是以,DNA,为模板的,RNA,聚合酶（合成方向,5,3,），与,DNA,聚合酶不同的是，它不需要引物，只需要,DNA,模板，就可以在其上合成新的,RNA,链。,(3),引物,RNA,的起始和终止的位置受解链酶、引发酶、模板顺序及其二级结构的影响。,（,4,）,DNA,聚合酶,切除前导链及冈崎片段的引物后,填补空缺，由,DNA,连接酶将切口连接。,RNA,引物的合成称作“引发”。,后随链的合成需多次引发作用，而发动前,导链的合成只需一次引发。,前导链的引物一般比冈崎片段的引物略长一,些，前者大约为,10,60,核苷酸，后者通常为,5,10,核苷酸。,成熟的,DNA,是不含,RNA,的，,RNA,引物最终被,DNA,所置换。,3,、,DNA,连接酶（,ligase,）,催化两段,DNA,之间的连接,:,3,5,5,3,5,3,5,3,HO,P,DNA ligase,NAD,ATP,NMN,AMP+PPi,+,DNA,连接酶（,1967,年发现）：,若双链,DNA,中一条链有切口,一端是,3,-OH,，另一端是,5,-,磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。,但它不能将两条游离的,DNA,单链连接起来。,磷酸基必需通过腺苷化激活。大肠杆菌和其它细菌的,DNA,连接酶需要,NAD,+,提,供能量,;,在高等生物和噬菌体中，则要,ATP,提供能量。,3,5,3,5,OH,P,4.,母本,DNA,双链的分离,(1),DNA,解链酶,(,解螺旋酶,Dna B),：通过水解,ATP,将复制叉前方的,DNA,双链打开。每解开一对碱基需要水解,2,个,ATP,分子。,(2),单链结合蛋白,(SSB),：稳定已被解开的,DNA,单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。,(3),DNA,旋转酶或拓扑异构酶,:,兼有内切酶和连接酶活性,可迅速使,DNA,两条链断开又接上,消除解链酶产生的拓扑张力。,当引入负超螺旋,时需要由,ATP,提供能量,同复制有关。,（三）终止,复制的最后，大肠杆菌染色体的两个复制叉在终止区域相遇，这个区域含有,20,个碱基对序列，叫做,Ter,序列,（,Terminus,，终止的意思）。该序列排列在染色体上造成一种陷阱，即复制叉到此就停止不再向前进行。,Ter,序列的功能是结合一种叫做,Tus,的蛋白质,(terminus utilization substance,即终止利用物质,).Tus-,Ter,复合体能够阻止单方向前进的复制叉，该复合体只能对一个复制叉起作用。,（三）终止,当一个复制叉遇到,Tus-,Ter,复合体时，复制停止；另一复制叉在遇到已停止的复制叉时复制也随之停止。最后的数百个位于这些大的蛋白质复合体之间的碱基对尚没被复制。,其后两条亲代母链解开，通过修复方式填补空缺，形成了两个交联在一起的环状染色体。这种拓扑互联环称为,连环体（,catenane,）,大肠杆菌的交联,DNA,环的分离需要拓扑异构酶,IV,（一种,II,型拓扑异构酶），分离开的染色体在细胞分裂时分别进入子细胞。包括真核生物的,DNA,病毒在内的其他环状染色体复制的终止机制都与此类似。,细菌复制终止区含有多个约,20bp,的终止子,(terminator),位点，,E.coli,有,7,个终止子位点。,总结,:,原核生物,DNA,的复制过程,:,(,以大肠杆菌为例,),起始,-RNA,引物的合成,DNA,链的延伸,终止,B.RNA,引物的合成,引发体先与,DNA,起始部位双链结合，通过,引物合成酶,形成前导链引物后，再沿,53,模板链与复制叉同向移动，在移动中断断续续形成冈崎片段的,RNA,引物。,A.,双链的解开,DNA,旋转酶,(,拓扑异构酶,),、,DNA,解链酶、单链结合蛋白协同作用,C.DNA,链的延伸,在,DNA pol,的催化下，以四种,dNTP,为底物，在,RNA,引物的,3,端以磷酸二酯键连接上脱氧核苷酸并释放出焦磷酸。,DNA,链的延伸同时进行领头链和后随链的合成。,5,3,5,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH 3,3,DNA-pol,前导链的延长：,DNA pol,全酶二聚体的一个亚基与前导链的模板结合而发挥催化作用，与复制叉同向。,滞后链的延长,滞后链上合成的冈崎片段是多种酶共同作用的结果。,DnaB,解旋酶和,DnaG,引物酶组成了一个复制的功能单元，称为引发体,(primosome),。,DNA,聚合酶,以其一套核心部分（核心聚合酶）连续合成前导链，同时，另一套核心聚合酶在滞后链环上从一个冈崎片段滑动到另一个冈崎片段。,当冈崎片段合成到一定长度，其,3,-OH,遇到上一个冈崎片段时即停止合成，,DNA,聚合酶,III,的核心部分与,滑动夹,(,及完成的冈崎片段）分离，然后再俘获新的,滑动夹，新的冈崎片段的合成开始。,一旦冈崎片段合成完成，通过,DNA,聚合酶,I,去除其,RNA,引物，以前一个冈崎片段的,3-,羟基为引物，催化合成,DNA,取而代之，并形成一个切口，这个切口由,DNA,连接酶连接封闭。,合成过程中复制复合物本身并没有不断移动，而是靠与质膜结合的,DNA,移动通过固定的复合物来实现。,这个合成的过程是相当快速的，新,DNA,的每条链,(,前导链和滞后链,),大约每秒添加,1000,个核苷酸。,DNA,聚合酶,催化领头链和随从链同时合成,D.,复制终止,细菌环状染色体的两个复制叉向前推移，在终止区相遇而停止复制，复制体解体。,这样,以两条亲代,DNA,链为模板，各自形成一条新的,DNA,互补链，结果形成了两个,DNA,双股螺旋分子。,复制的保真性,(fidelity),主要依赖,3,种机制：,聚合酶对碱基的选择；,3 5,方向的,外切核酸酶活性起校正作用,;,复制后错配现象的特异性修复机制。,5.DNA,聚合酶的“校对”,(proofreading),作用,大肠杆菌,DNA,复制错配率约,10,-9,10,-10,。其染色体中有,4.5,10,6,bp,，平均每,1 000,10 000,个细胞经过一次分裂才会插入一个不正确的碱基。,小结,维持,DNA,复制准确性的因素：,内因,:,按碱基配对原则,DNA,聚合酶的作用,对碱基的识别作用,-,选择正确的碱基掺入到引物末端；,对底物的识别作用,-,先识别引物最后一个碱基是否正确,后识别掺入的,dNTP,是否正确；,校正阅读,-3 5,外切酶的作用；,RNA,引物最终被切除,提高了复制准确性；,复制完成后对错配碱基进行修复的酶系统。,外因：,四种,dNTP,要平衡；,Mn,2+,和,Mg,2+,的比例、浓度（酶活）,DNA,复制的分子机制的基本特点,复制的结果是半保留复制，复制的过程是半不连续复制。,复制以复制单位进行，起始于特定的位点（复制起点）。,复制可以是单向，也可以是双向，后者更为常见。,复制时，,DNA,的两条链都从,5,端向,3,端延伸。,前导链是连续合成，而后续链是不连续合成。,DNA,的合成始于,RNA,引物的合成，因此前导链只有一次,RNA,合成，滞后链的冈崎片断每个都有,RNA,引物的合成。,RNA,引物随后由,DNA,片段替换，相邻的,DNA,片段连接形成一条完整的,DNA,链。,DNA,聚合酶的校对功能和细胞的错误修复功能维持,DNA,分子的准确性和忠实性。,第二节 真核生物的,DNA,复制,真核生物中的,DNA,分子通常比大肠杆菌等原核生物大；,真核生物的,DNA,通常都与组蛋白构成核小体，以染色质的形式存在于细胞核中；,真核生物,DNA,复制的冈崎片段长约,200bp,左右，相当于一个核小体,DNA,的碱基对长度。,一、,真核生物的,DNA,聚合酶,DNA-pol,现认为其功能只是合成引物,DNA-pol,在复制延长中起催化作用,DNA-pol,校对、修复、填补,(,类似,E.coli,DNA pol I,),DNA-pol,线粒体,DNA,合成,DNA-pol,核,DNA,修复,与原核生物的,DNA,聚合酶相似：均以,4,种脱氧核苷三磷酸为底物，需,Mg,2+,激活，有模板和含有游离,3-OH,引物存在，新链向,53,方向延伸。,48,4,细胞核染色体的复制由,DNA,聚合酶,、,和,共同完成。聚合酶,合成引物，聚合酶,是主要的复制酶，聚合酶,可能相当于细菌,DNA,聚合酶,，是修复酶，也有报道它参与前导链的合成。,DNA,聚合酶,与另一种称为,增殖细胞核抗原,（,proliferating cell nuclear antigen,PCNA,）的复制因子相结合，构成真核生物的复制复合体，该因子由四个相对分子量为,29 000,的亚基组成一个环状的同源四聚体。,PCNA,相当于大肠杆菌,DNA,聚合酶,的,亚基,，它形成的环状夹子稳定,DNA,聚合酶,和,DNA,的相互作用，极大增加聚合酶的持续合成能力。,现也有报道一些新发现的,DNA,聚合酶如,DNA,聚合酶,、,、,、,和,Rev1,他们主要参与,DNA,的损伤修复，因此保真性较低。,在真核生物的,DNA,复制中，,复制蛋白,-A,（,replication protein A,RPA,）是真核生物的单链,DNA,结合蛋白，相当于大肠杆菌的,SSB,蛋白。,复制因子,-C,（,replication factor C,RFC,）由一个大亚基（,145kD和四个小亚基（,40,，,38,，,37,和,36kD,）组成，,具有,DNA,依赖的,ATP,酶活性,，是夹子装置器（,clamp loader,），相当于大肠杆菌的,复合体，帮助,PCNA,因子在,DNA,双链的装卸。此外，它还促进复制体的装配。,二、染色质复制,也可以分为起始、延伸和终止三个阶段。,也是,DNA,聚合酶和多种蛋白的协调作用的结果。,在复制叉上有一个,DNA,聚合酶,，以合成引物；,DNA,聚合酶,和,DNA,聚合酶,，分别合成前导链和滞后链。,1.,起始复合体,(origin recognition complex,ORC),ORC,以一种依赖,ATP,的方式结合到起始位点，并作为其它起始因子的装配骨架。,ORC,所结合的,DNA,序列变化非常大。,ORC,的定位与起始的选择涉及到许多精细调控途径，也受,ORC-,染色质上游和下游许多调节因子的作用，但是目前仍不清楚,ORC,是如何发现这些序列。,1.,起始复合体,(origin recognition complex,ORC),真核生物合成,DNA,时，首先构建,前起始复合体,。在,G1,期,ORC,先结合到,DNA,上，然后,核复合体相关蛋白,（,nucleolar complex-associated proteins,NOC,）、,CDC6,（,cell division cycle,，,细胞分裂周期蛋白,）和,CDT1,（,CDC10 dependent transcript,CDC10,依赖性转录因子,），以及,MCM27,(minichromosome maintenance protein,微小染色体维持蛋白,),复合体等依次结合上来，在结合,MCM,后，,CDC6,和,CDT1,从复制前起始复合体脱落，形成一个有效,复制前起始复合体,。,1.,起始复合体,(origin recognition complex,ORC),在,G1/S,转换时，,CDC45,、,TOPBP1(topoisomerase II binding protein1,拓扑异构酶,II,结合蛋白,1,）和,MCM810,协助,GINS,(go ichi ni san,，,pol,辅助因子）,复合物的加载，,DNA,解螺旋，,DNA,聚合酶的结合，使复制前起始复合体转变成,复制起始复合体,。,图,5-15.,真核细胞核,DNA,复制的模型,（,A,）起始前复合物的组成。,（,B,）起始复合物的组成。,（,C,）,DNA,复制叉的组成。,CDT1,CDC6,ORC,NOC3,MCM,2-7,CDC45,GINS,2-7,MCM,ORC,NOC3,MCM8,MCM10,MCM9,TOPBP1,pol,PCNA,RFC,RPA,pol,GINS,CDC45,MCM,2-7,前导链,滞后链,MCM8,MCM10,MCM9,（,C,）延伸,（,B,）起始,（,A,）起始前,pol,2.,复制,复制起始复合体形成后，,MCM27,，,CDC45,和,GINS,使双螺旋,DNA,解旋。,GINS,促进,pol,的聚合作用，,前导链合成主要由,pol,来完成。,在,滞后链,上，,RPA,稳定,ssDNA,，,pol,先合成一个,10,个核苷酸的,RNA,引物，继之在引物的,3,端合成,20,30,个脱氧核苷酸的,DNA,片段，然后被,pol,替代，由其完成冈崎片段的合成。,RFC,协助,PCNA,（增殖细胞核抗原）加载到,pol,上，增加,pol,的持续合成能力，而,MCM810,在此过程中准确地作用尚不清（图,5-15,，,C,）。,2.,复制,在滞后链的合成中，相邻冈崎片段的连接是在核酸酶、,FEN1,（,flap endonuclease1,侧翼核酸内切酶,）、,DNA,聚合酶等共同作用下完成。,RNA,引物被,RNase H1,、成熟因子,-1(maturation factor,，,MF,）等核酸酶水解，然后由,DNA,聚合酶,填补缺口，,DNA,连接酶连接切口，图,5-16,提供了目前大家比较公认的三个滞后链连接模型。,在,DNA,合成时究竟是酶在移动还是,DNA,在移动？,最近研究表明,DNA,聚合酶在合成,DNA,时为固定状态，原核生物的,DNA,聚合酶固定在细胞膜上，真核生物固定在核基质上。,所有参与,DNA,复制的酶和蛋白质，也包括固定,DNA,聚合酶的蛋白质都固定在同一位置，从而构成复制体。,DNA,复制过程中复制子与复制体结合，形成复制簇。,新合成的,DNA,从复制体向外滑出，同时亲代,DNA,通过固定点向内移动。在此过程中亲本链形成的环逐渐收缩，复制链形成的环不断增大。这样,DNA,进入复制体被复制，进去的是母链，出来的是子链（图,5-18,）。,图,5-18.,复制子簇内,DNA,复制模型,复制起点,亲本链,复制链,复制体,复制链,复制起点,亲本链,复制体,真核生物中,DNA,的复制特点,1,、,真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。,2,、冈崎片段长约,200bp,。,3,、真核生物,DNA,复制速度比原核慢。,4,、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。,真核生物中,DNA,的复制特点,5,、真核生物有多种,DNA,聚合酶。,6,、真核生物线性染色体两端有,端粒,结构，防止染色体间的末端连接。由,端粒酶,负责新合成链,5,端,RNA,引物切除后的填补，亦保持,端粒,的一定长度,。,7,、真核生物的染色体以核小体为结构单位，在其复制时，组成核小体的组蛋白是全保留式的复制。,8,、,真核生物,DNA,的复制要复杂的多，目前仍有许多未解之谜。,端粒,端粒,中心粒,图 真核生物染色体,端粒,(telomere),是真核生物线性染色体的两个末端所具有的特殊结构,其共同特点是一条链上富含,T,、,G,短序列的多次重复,而其互补链上富含,A,、,C,。,三、端粒的复制,端粒主要有两大生理功能：,（,1,）维持染色体结构的完整性，防止染色体被核酸酶降解及染色体间相互融和。,（,2,）防止染色体结构基因在复制时丢失，解决了末端复制的难题。,DNA,复制时，,DNA,聚合酶必须在,RNA,引物基础上从,5,向,3,方向延伸，而,5,端,RNA,引物去除后因无引物的存在而不能复制，结果每复制一次染色体末端将丢失一段序列。端粒的存在使每次丢失的仅为端粒的一部分，从而保护了染色体内部的结构基因。另外，有些研究还显示，端粒与核运动有关，可能对同源染色体的配对重组有重要意义。,线性,DNA,在复制完成后，其末端由于引物,RNA,的水解而可能出现缩短。故需要在,端粒酶,(,telomerase),的催化下，进行延长反应。,5,3,3,5,5,3,3,5,端粒酶是一种,RNA-,蛋白质复合体，它可以其,RNA,为模板，通过逆转录过程对末端,DNA,链进行延长。,端粒酶的爬行模型（动画演示）,母链藉非标准碱基配对回折,DNA,聚合酶,端粒合成完成,进一步加工,四、,DNA,复制的调控,就目前所知，起始阶段是,DNA,复制中唯一的一个可以受调节的阶段，由于受到调节而使得真核细胞在一个细胞周期中发生一次复制。调节的机制尚未了解清楚。,原核生物的调控,原核生物,DNA,的甲基化以及与细胞质膜的相互作用可以影响复制的起始时间。,Dam,甲基化酶,可以使,ori,C DNA,甲基化，甲基化发生在回文序列,GATC,中腺嘌呤的,N,6,位（,Dam,代表腺嘌呤甲基化的缩写,）。,大肠杆菌的,ori,C,区域有很多,GATC,序列片段，这一片段在大肠杆菌染色体中的平均频率是每,256,个碱基对中有,1,个，而在,ori,C,区域的,245,个碱基对中就有,11,个这样的片段。,原核生物的调控,复制完成后，,DNA,是半甲基化即,ori,C,区域的母链是甲基化，而新合成的链没有甲基化。,ori,C,的半甲基化序列会在质膜上滞留一段时间（机制尚不清楚）。,当,ori,C,从质膜上释放出来，在它再次与,DnaA,结合并,引发,DNA,复制之前，它必须由甲基化酶将其甲基化,。,复制起始的,调节可能也涉及到由,DnaA,蛋白质引起的,ATP,的缓慢水解,，因为这种调节使,DnaA,蛋白质在活化态（与,ATP,结合）和非活化态（与,ADP,结合）间发生循环变化。,真核生物的调控（,远比原核生物更为复杂）,真核生物的细胞有多条染色体，每一条染色体上有多个复制起点，所以是多复制子。它们的,复制是由时间控制,，并不是所有起点都是同一时间被激活的，而是有先有后。,复制时间与染色质结构、,DNA,甲基化及转录活性有关。通常活性区先复制，异染色质区晚复制。,复制是双向的，相邻两复制起点形成的复制叉相遇后借助拓扑异构酶而使子代分子分开。,真核生物的调控（,远比原核生物更为复杂）,真核生物似乎没有复制终止子,。染色体复制在一个细胞周期中只发生一次，所有基因既无丢失，也不会过剩。这一机制被认为是,复制许可因子,（,replication licensing factor,）所控制。该因子为复制起始所必需，但一旦复制起始后它即被灭活或者降解。,由于复制许可因子不能通过核膜，只能经过有丝分裂在重建核结构时才能进入核内并作用于染色体的复制起点，这使其仅在有丝分裂后期才能与复制起点相互作用。,真核生物的复制起始是受多种因子的调控，这些,因子的磷酸化和去磷酸化直接影响着复制的起始。,第三节,DNA,的损伤修复,DNA,的损伤：,DNA,在复制时产生错配、病毒基因整合，某些理化因子如紫外线、电离辐射和化学诱变等，破坏,DNA,的双螺旋结构，从而影响,DNA,的复制，并使,DNA,的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（生物突变）。,引发突变的因素,物理因素,紫外线,(ultra violet,UV),、各种辐射,UV,化学因素,目 录,突变分子的改变类型,错配,(mismatch),缺失,(deletion),插入,(insertion),重排,(rearrangement),框移,(frame-shift),DNA,分子上的碱基错配称,点突变,(point mutation),。,发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。,1,.,转换,发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。,2.,颠换,（一）错配,镰形红细胞贫血病人,Hb(HbS),亚基,N,-val,his,leu,thr,pro,val,glu,C,肽链,C,A,C G,T,G,基因,正常成人,Hb(HbA),亚基,N,-val,his,leu,thr,pro,glu,glu,C,肽链,C,T,C G,A,G,基因,（二）缺失插入,和框移,缺失：,一个碱基或一段核苷酸链从,DNA,大分子上消失。,插入：,原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到,DNA,大分子中间。,框移突变,是指三联体密码的阅读方式改变，造成肽链氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致,框移突变,。,谷 酪 蛋 丝,5 ,G,C,A,G U A,C A U,G U C,丙 缬 组 缬,正常,5 ,G A G,U A C,A U G,U C,缺失,C,缺失引起框移突变,（三）重排,DNA,分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,目 录,DNA,损伤的修复,修复,(repairing,),是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,错配修复,切除修复,(direct repairing),直接修复,(excision repairing),重组修复,(recombination repairing),SOS,修复,修复的主要类型,一、错配修复（,mismatch repair,）,原核生物：,依赖于模板链所提供的信息，可提高复制的忠实性,10,2,10,3,。,修复系统须首先识别模板和新合成的链；链的识别是依赖于,Dam,甲基化酶的作用，酶使,DNA,的,5-GATC,序列中腺嘌呤的,N,6,位甲基化。,在,DNA,复制后的一段时间，模板甲基化而新链不甲基化，未被甲基化的,GAT