免疫组化讲课-原理及方法.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,你们好,免疫组织化学技术的原理及方法,免疫组织化学技术的原理及其方法,一,.,基本知识,二,.,基本原理,三,.,方法,四,.,结果的判断及异常着色原因分析和对策,一、免疫组化技术的基本知识,一、免疫组化技术的基本知识,免疫组化的基本概念,利用抗原,-,抗体特异性结合原理检测抗原或抗体一般是用抗体检测抗原,抗原,两个主要属性：免疫原性及特异反应性，蛋白质具有抗原性,抗体,与抗原能特异性结合,生物学结合是免疫球蛋白,Ig,免疫球蛋白的化学结构及其模式图,免疫球蛋白根据重链结构命名,IgG(),IgA(,),，,IgD(),IgE(),IgM(,),五种免疫球蛋白只有两种类,型的轻连，即：,Kappa(,),和,Lambda(,),每个抗体分子的轻链必须相同；某一单独的抗体分子 决不可能既有,链又有,链。这一点在免疫组化的淋巴瘤诊断中十分重要。,免疫球蛋白的化学结构及其模式图,Fc(Fragment,crystalline),是免疫球蛋白的羧基端，意为结晶片段，因其纯化时呈结晶状态而名之，该片段与抗原特异性有关,Fab(Fragment antigen bingding,),该端是抗体与抗原特异性结合的部位，每分子,Ig,能结合,2,个抗原分子,F,c,F,ab,A,g,多克隆抗体与单克隆抗体及其产生,多克隆抗体：多株,B,细胞针对多个抗原决定簇产生的抗体,单克隆抗体：针对某一抗原决定簇，由单株淋巴细胞（克隆）所产生的抗体,多克隆抗体,单克隆抗体,多克隆抗体与单克隆抗体及其产生,多克隆抗体的产生,以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理诊断中，有利划归肿瘤的基本类型。,常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目录上常以,RaH,（,Rabbit against Human,）表之。,多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用至关重要。,多克隆抗体与单克隆抗体及其产生,单克隆抗体的产生,应用细胞融合的杂交瘤技术（,Hybridization,），以针对单一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨髓瘤细胞（肿瘤性,B,细胞）融合形成杂交瘤，其特点是既能产生特异性抗体，又能在体外无限地增殖。将瘤细胞在体外培养或注入小鼠腹腔内而获单克隆抗体，由此产生的小鼠抗人（抗原）的抗体常以,MaH,表示，现在亦有兔的单克隆抗体,免疫小鼠,Mouse,抗原的制备：,传统用蛋白提纯,近来可应用分子生物学技术：已知抗原的基因结构，用其合成多肽，作为抗原，如,ER,、,PR,抗原的制备,现有兔的单抗,多克隆抗体和多克隆抗体的选用,单克隆抗体的制备比多克隆抗体复杂，价格更贵；在应用中不一定比多克隆抗体好。,单克隆抗体的特异性强，多克隆抗体则敏感性高，为何使用完全决定于使用的目的性,市售抗体的种类,某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗体，如,-,胰蛋白酶,有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检测。如,Desmin,来源于鸡的肌肉,近年来,市售单克隆抗体除小鼠源性外，还有兔源性,标记抗体,在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体的结合能用肉眼观察到,标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明,酶：辣根过氧化酶，硷性磷酸酶,金属离子：胶体金颗粒,标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性，从而使染色敏感性降低,酶,抗酶抗体复合物,通过免疫反应而不是化学方法，将酶结合到抗体上，形成具酶活性的免疫复合物。如,PAP,复合物,（,Peroxidase AntiPeroxidase,Complex,）,，,PAP,复合物属非标记性，保护了酶的活性，比免疫荧光法敏感上千倍。,亲和素,生物素复合物,（,Avidin,-Biotin Complex ABC,）,亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合,亲和素,-,生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性,AB,复合物多用于,ABC,法的免疫组化中,酶标亲和素（,Labelled streptavidin,）,在,AB,复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素,-,生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此,LSAB,法比,ABC,法更敏感,多聚物载体,一步法及二步法载体试剂，可分别称,DAKO EPOS,及,DAKO Envision,试剂,核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用,一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能与二抗相联结的由,HRP,标记的多聚物,一步法：,EPOS,tissue antigen,dextran,backbone,primary antibody,enzyme molecule,二步法：,EnVision,葡萄球菌蛋白,A,（,Staphylococcal protein A,SPA,）,二、免疫过氧化物酶染色技术的基本原理,免疫过氧化酶染色技术的基本原理,识别系统,特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。特异性抗体具有识别并结合靶抗原的功能，这是本技术的理论依据所在,特异性抗体品种繁多，应根据待检测抗原的要求选用,特异性抗体有的属单抗，有的属多抗，有的既有单抗又有多抗，可根据不同染色要求而选用,识别系统的组成比较恒定，识别功能由特异的第一抗完成,显示系统,也是显色系统。抗体抗原的结合是肉眼看不见的，显示系统的目的就是使这种看不见的反应变为看得见，从而确定抗原的存在及其定位,显色系统由酶、底物加上显色剂组成，最终可在标记位点形成有色分子的终末产物，若显色剂为,DAB,，则出现棕褐色细颗粒沉淀,E(,酶,)+S(,底物,)E,S(,酶底物复合物,),P(,反应产物,),+E(,酶,),循环使用,显示系统,辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程,:,HRP+H,2,O,2,HRP,H,2,O,2,有色分子终末产物,+HRP,DAB,（电子供体）,HRP,：酶,H,2,O,2,：底物,HRP,H,2,O,2,：酶,底物复合物,免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点在于显色系统的差异：,间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶,PAP,法：利用,PAP,复合物,ABC,法：利用,AB,复合物,LSAB,法,:,利用直接标记于亲和素的酶,EPOS,一步法及,EnVision,二步法：多聚物载体,其目的都是设法提高免疫组化染色的敏感性,显示系统,联结系统,联结或桥联抗体（一般为第二抗体）,按免疫学要求将识别系统与显色系统联结成为统一体,应采用何种联结抗体决定于特异性第一抗体是多克隆还是单克隆：,若一抗是多克隆抗体，则二抗是羊或其它动物的抗兔血清；,若一抗是单克隆抗体，则二抗常是兔抗鼠的血清,有的联结抗体既能联结多抗，亦能联结单抗,三、免疫组化染色方法的类别,免疫组化染色方法的类别,直接法,间接法,PAP,法,ABC,法,LSAB,法,一步法（,EPOS,）,两步法（,Envision,）,直接法,将荧光、酶、金直接标记在一抗上进行显色，没有联结系统、未用桥抗体。,优点：特异性高、非特异染色轻。,缺点：敏感性低，要求抗体浓度高。每种一抗均需用酶来标记,间接法,将标记物标记在桥联抗体上（即二抗、三抗）,一抗往往是兔身上产生的多克隆抗体，其酶标抗体必须是针对兔,优点：敏感性高，只需少数几种动物的二抗就可以和所有一抗相匹配,缺点：特异性差,Primary Antibody,Secondary Antibody,Substrate-chromogene,solution,PAP,法,（,Peroxidase-AntiPeroxidase,，过氧化酶,-,抗过氧化酶法）,组成：,一抗是针对靶抗原的特异性抗体,二抗是联结抗体，一面联结一抗，另一面联结,PAP,复合物,三抗是以过氧化物酶为抗原，在与一抗同种动物身上诱发产生的抗体，并与辣根过氧化物酶形成复合物（,PAP,）,PAP,法,（,Peroxidase-AntiPeroxidase,，过氧化酶,-,抗过氧化酶法）,优点：,PAP,复合物中含酶更多，且是一种非标记的免疫组化方法，敏感性更高,PAP,复合物常来自两种不同的动物（鼠、兔），鼠,PAP,用于一抗为单克隆抗体的染色，兔,PAP,多用于一抗为多克隆抗体的染色,可用于福尔马林固定的石蜡切片,PAP,Primary Antibody,Secondary Antibody,Peroxidase-anti-Peroxidase,Substrate-chromogene,solution,ABC,法,（,Avidin,-Biotin Complex,，亲和素,-,生物素法）,组成：,一抗、生物素化的二抗、,ABC,复合物（亲和素,+酶标生物素）,优点：,亲和素和生物素有强大亲和力，使其比直接和间接酶标法更敏感，也超过,PAP,法。,能用于常规石蜡切片。,亲和素,生物素复合物,（,Avidin,-Biotin Complex ABC,）,亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合,亲和素,-,生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性,AB,复合物多用于,ABC,法的免疫组化中,ABC,法,（,Avidin,-Biotin Complex,，亲和素,-,生物素法）,一抗,二抗,ABC,DAB,ABC,ABC,与,PAP,法的比较,LSAB,（,SP,）法,（,labelled streptavidin,biotin method,）标记的链霉亲和素,-,生物素法,特点：将,HRP,直接标记于链霉亲和素上,优点：,更快速：空间结构更小,更敏感：链霉亲和素的亲和性更强，更易于到达深部位点,非特异背景更少：链霉亲和素空间结构特殊，不易与高荷电的组织成分（胶原纤维、结缔组织）联结,酶标亲和素（,Labelled streptavidin,）,在,AB,复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素,-,生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此,LSAB,法比,ABC,法更敏感,SP,Primary Antibody,Biotinylated,Secondary Antibody,Ensyme-conjugated,Streptavidin,Substrate-chromogen,solution,ABC,与,LSAB(SP),法的比较,一步法（,EPOS,）及两步法（,Envision,）,特点,以多聚体为载体，联结了酶和一抗（一步法）或二抗的,Fab,段和酶（二步法）,优点,操作简便，省时,提高了敏感性和特异性,减少了背景着色,避免内源性生物素的干扰,多聚物载体,一步法及二步法载体试剂，可分别称,DAKO EPOS,及,DAKO Envision,试剂,核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用,一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能与二抗相联结的由,HRP,标记的多聚物,一步法：,EPOS,tissue antigen,dextran,backbone,primary antibody,enzyme molecule,二步法：,EnVision,一步法（,EPOS,）及两步法（,Envision,）比较,Substrate-chromogen,solution,EPOS,一步法,Primary Antibody,Polymer complex,Substrate-chromogen,solution,EnVision,二步法,四、免疫组化染色结果的判断及异常着色的原因分析及其对策,特异性着色具备特点,特定的组织,特定的定位,特定的细胞,特定的细胞内的部位,分布上的不均一,着色的不均一性,着色强度的不均一,颗粒性显色：,DAB,显色剂应为棕黄到棕褐色,免疫组化染色结果的判断,CK,染色，结肠腺癌细胞膜特异性着色,Kappa,胞浆着色,TdT,染色，胞核着色,PR,胞核着色,ER,胞核着色,免疫组化染色结果的判断,对照的设置,空白对照,阳性对照,吸收试验对照,替代对照自身对照,异常着色（假阳性）原因及对策,异常着色原因,内源酶及内源性生物素,抗体本身原因,切片制作不当,冲洗不充分,DAB,显色产生背景着色,抗原的丢失,抗原的遮蔽,抗体试剂因素,操作不当,假阴性的原因,内源酶及内源生物素,非特异性着色原因及对策,灭活过氧化物酶,-3%H2O2,灭活内源性生物素,-,蛋清封闭或更换不含生物素的染色系统,灭活碱性磷酸酶,Desmin,抗体自身原因,抗体不纯,-,应用单克隆抗体,标本中含有与靶抗原相似的抗原决定簇,-,采用具更特异性抗原决定簇的单克隆抗体,异常着色原因及对策,S-100,异常着色原因及对策,切片制作不当,严重变性坏死及炎性病灶处,切片裱贴不平,褶皱处,组织边缘部,异常着色原因及对策,清洗不充分,用含盐的缓冲液充分冲洗，可利于减低背景着色,DAB,显色产生背景着色,未除去,DAB,的不溶性颗粒,DAB,保存不妥，其氧化产物沉淀在组织上,电荷吸附,加二抗动物非免疫血清,牛血清也常用,非特异性背景着色原因及对策,假阴性的原因分析及对策,抗原的丢失,标本固定不及时、固定过久，浸蜡时间、温度过高，均可将抗原性破坏,抗原的遮蔽,福尔马林固定石蜡包埋后，其抗原性因分子交联而被遮蔽,修复抗原，包括蛋白酶消化、微波加热处理,无信号片,Mart-1,染色,修复,未修复,假阴性的原因分析及对策,假阴性的原因分析及对策,抗体的因素,有效性：一抗的特异性、效价、保存时间、保存条件及有无菌类污染,抗体间的相互匹配：二抗与一抗、三抗与二抗不匹配，三抗必须是一抗同种动物来源的同型抗体,操作不当,掉片,消化了不该消化的靶抗原,切片放置不平抗体流失,遗漏重要操作步骤（如漏加,HRP,的底物）,显色时间过短,假阴性的原因分析及对策,解决方法：严格按操作步骤进行,谢谢！,