任务1-黑曲霉菌种活化、复壮及保藏.pptx

Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,01 三月 2026,1,任务,1,：黑曲霉菌种活化、复壮及保藏,任务描述,保藏菌种时为减少变异，尽量降低菌的代谢活性。保藏的菌种拿出使用时，首先要转接到新鲜的培养基上并给予合适的培养条件让菌恢复生长，即进行,活化,。菌种在使用过程中，需有意识经常进行纯化和复壮，防止衰退。,此次任务中，我们需要对保藏的菌种进行活化和复壮。具体任务包括：麦芽汁培养基的制备制备平板和斜面菌种分离纯化根据变色圈选出活力高的菌株接种斜面沙土管保藏菌种。,01 三月 2026,2,任务目标,知识目标：,1,、掌握菌种保藏的原理及方法；,2,、了解菌种退化的原因和防止衰退的方法；,3,、了解菌种复壮的概念和方法；,4,、了解菌种活化的概念及方法。,能力目标：,1,、学会菌种活化和复壮的操作方法；,2,、学会孢子斜面接种；,3,、学会沙土管保藏菌种的操作方法。,素质目标：,1,、无菌意识,01 三月 2026,3,任务实施,【实施准备】,1,、仪器设备,超净工作台；恒温培养箱；灭菌锅；天平；水浴锅；接种环；涂布棒、移液管、试管、烧杯、,500ml,三角瓶、培养皿等若干，,10mL,无菌水试管,1,支，,9 mL,无菌水试管,6,支。,2,、材料,菌种：,黑曲霉（本实验室保存）,培养基：,斜面培养基（麦芽汁培养基）：,150g,麦芽粉加入,400mL60,温水，搅匀，放入水浴锅内液化至加碘液不变蓝，煮沸，过滤得麦芽汁，加水调至,5,0,Be,，琼脂,2%,，,pH,自然，,121,灭菌,20min,。,分离培养基：上述,斜面培养基加,0.02%,溴甲酚绿，,pH,自然，,121,灭菌,20min,。,河沙、瘦黄土,(,有机物含量少的黄土,),；,01 三月 2026,4,【实施步骤】,（一）菌种活化与复壮,1,、配制斜面培养基和分离培养基，和无菌水试管、涂布棒、移液管等一起灭菌；,2,、摆放斜面、倒平板，并对保藏的斜面菌种进行,10,倍梯度稀释至,10,-6,，制成孢子悬液；,3,、选取,10,-4,、,10,-5,、,10,-6,三个浓度稀释菌液，每个浓度分别取,0.1mL,，涂布两块平板。,4,、待菌液渗入培养基后倒置于培养箱，,35,培养；,5,、由于产酸，,2-3d,后菌落周围会出现黄色变色圈，在变色圈尚未连成一片时，测定变色圈与菌落直径之比，将比例大的单菌落进行标记；,6,、,4-5d,后待孢子成熟，移接于麦芽汁琼脂斜面培养基上，,35,培养至长出浓密孢子备用。,01 三月 2026,5,(,二,),菌种保藏（沙土管保藏法）,L,、沙土处理,(1),沙处理：取河沙经,40,目过筛，去除大颗粒，加,10%HCl,浸泡,(,用量以浸没沙面为宜,)2,4h(,或煮沸,30min),，以除去有机杂质，然后倒去盐酸，用清水冲洗至中性，烘干或晒干，备用。,(2),土处理：取非耕作层瘦黄土,(,不含有机质,),，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性，然后烘干，粉碎，用,100,目过筛，去除粗颗粒后备用。,2,、装沙土管,将沙与土按,2,：,1,，,3,：,1,或,4,：,1(W/W),比例混合均匀装入试管中,(10mm,100mm,，装置约,7cm,高，加棉塞，并外包牛皮纸，,12l,湿热灭菌,30min,，然后烘干。,3,、无菌试验,每,10,支沙土管任抽一支，取少许沙土接入牛肉膏蛋白胨或麦芽汁培养液中，在最适的温度下培养,2,4d,，确定无菌生长时才可使用。若发现有杂菌，经重新灭菌后，再作无菌试验，直到合格。,01 三月 2026,6,4,、制备菌液,用,5mL,无菌吸管分别吸取,3mL,无菌水至待保藏的菌种斜面上，用接种环轻轻搅动，制成悬液。,5,、加样,用,1mL,吸管吸取上述菌悬液,0.1,0.5mL,加入沙土管中，用接种环拌匀。加入菌液量以湿润沙土达,2/3,高度为宜。,6,、干燥,将含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器内用培养皿盛,P,2,O,5,作为干燥剂，可再用真空泵连续抽气,3,4h,，加速干燥。将沙土管轻轻一拍，沙土呈分散状即达到充分干燥。,7,、保藏,沙土管可选择下列方法之一来保藏：,(1),保存于干燥器中；,(2),用石蜡封住棉花塞后放入冰箱保存；,(3),将沙土管取出，管口用火焰熔封后放入冰箱保存；,(4),将沙土管装入有,CaCl,2,等干燥剂的大试管中，塞上橡皮塞或木塞，再用蜡封口，放入冰箱中或室温下保存。,7,8,、恢复培养,使用时挑取少量混有孢子的沙土，接种于斜面培养基上，或液体培养基内培养即可，原沙土管仍可继续保藏。,此法适用于保藏能产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌，可保存,2,年左右。但不能用于保藏营养细胞,。,