微生物限度方法学验证.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,微生物限度检查方法的验证,微生物限度检查方法的验证,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,准确性（回收率）,控制菌检查法的验证,专属性,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,验证的目的：,确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌、酵母,菌数的测定。照此检查法和检验条件进行供试品细菌、,霉菌、酵母菌数检查能保证检验结果的准确、可靠。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,验证的步骤：,根据样品特性，制定检验方法和检验条件。,保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试验要求。,按制定的方法进行试验。,根据验证结果，判断是否符合验证的标准。若符合,按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，应重新设立验证方案，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,细菌计数验证用菌株：,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯,草芽孢杆菌。,霉菌、酵母菌计数,验证用菌株,：,白色念珠菌、黑曲霉。,菌株选择的原则:,代表性,普遍性,低或非致病性,标准,菌株(或该药品中常见的污染菌)。,菌种的要求：,不得超过5代。采用适宜的方法保存。加菌,量:50100,cfu,。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,验证方法选择：,平皿法（包括稀释法,）,、,薄膜过滤法,、,中和法、离心沉淀法、联合方法。,样品稀释级的选择：,最低稀释级，1,g,或1,ml,。,培养基：,营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、,营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,菌液制备,(1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌,的新鲜培养物至10,ml,营养肉汤中，3537培养1824小,时，取此培养液1,ml,加0.9无菌氯化钠溶液9,ml，,采用10倍,递增稀释法，稀释至10,-5,10,-7,，使菌数约为50100,cfu,/ml。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,菌液制备,(2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至10,ml,改良马丁培养,基中，2328培养1824小时，取此培养液1,ml,加0.9,无菌氯化钠溶液9,ml，,采用10倍递增稀释法，稀释至10,-5,10,-7,，使菌数约为50100,cfu/ml。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,菌液制备,(3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培,养基上，2328培养57天，加35,ml0.9,无菌氯,化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取 1,ml,菌液加0.9,无菌氯化钠溶液9,ml，,采用10倍递增稀释法，稀释至10,-4,10,-6,，使菌数约为50100,cfu/ml。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,供试品的处理：,固体：10,g,供试品+稀释剂至100,ml,液体：10,ml,供试品+稀释剂至100,ml,抑菌性供试品可采用加中和剂、自然沉降、离心或,薄膜过滤。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,菌液组,供试品对照组,试验组,稀释剂对照组,每一验证菌株均应进行上述试验（顺序）。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,菌液组：,测定所加的试验菌数。,平皿法：,取试验用的1,ml,菌液（约50100,cfu,）,，分别注,入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2,个平皿，按平皿法测定其菌落数。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,供试品对照组：,取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。,（和试验组采用同法）,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,试验组：,平皿法：,取试验可能用的最低稀释级供试液1,ml,和50,100,cfu,试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，,每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,试验组：,培养基稀释法（平皿法）：,取试验可能用的最低稀释级,供试液1,ml,分别注入,n,个平皿，每个平皿再注入50100,cfu,试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每,株试验菌平行制备2份，按平皿法测定其菌落数。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,试验组：,薄膜过滤法：,取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，,过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入50100,cfu,试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数,。,至少要一张,膜。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,试验组：,离心沉淀法：,取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，,如供试液含许多药渣，先以低速500,r/min,离心35,min，,取上清液，再以3000,r/min,离心1030,min，,取下面1,ml,液体（,A)，,并用适当的稀释剂洗涤管底，将洗涤液与液,体（,A),一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,稀释剂对照组：,若供试液制备需要分散、乳化，中和、,离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，,可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验菌，使最终菌,浓度为每1,ml,供试液含50100,cfu,，,按试验组的供试液,制备方法和菌落计数方法测定其菌数。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,计数方法的验证,结果判断指标,试验组的菌回收率（70%）,稀释剂对照组的菌回收率（70%）,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,试验组的菌回收率计算：,（试验组菌落计数-,供试品对照组,菌落计数）,菌液组,%,稀释剂对照组,的菌回收率计算：,稀释剂对照组,菌落计数,菌液组,%,每一验证菌株均应进行上述试验。,验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计,算各试验菌每次试验的回收率。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,验证细菌各平皿倾入营养琼脂培养基。,验证霉菌、酵母菌各平皿倾入玫瑰红钠琼脂培养基。,置规定温度培养48或72,h,菌落计数。计算回收率。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,回收率测定举例,供试液不用特殊制备方法,常规法,菌液组：,1,ml,菌液/平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平均菌,数：,C),供试品对照组：,最低稀释级供试液1,ml,/平皿，平行,2,个平皿,（计算供试液平均菌数：,B）,试验组：,最低稀释级供试液1,ml+1ml,菌液/平皿，平行2个平皿,（计算供试液平均菌数：,A）,回收率=(,AB),C,%,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,回收率测定举例,供试液不用特殊制备方法,培养基稀释法（5个平皿）,菌液组：,1,ml,菌液/平皿，每株菌平行2个平皿（计算平均菌,数：,C),供试品对照组：,最低稀释级供试液1,ml,分别注5个平皿，0.2,ml/,平皿，平行2份，共10个平皿（计算0.2,ml,供试液,平均菌数：,B）,试验组：,最低稀释级供试液0.2,ml+1ml,菌液/平皿，注5个平,皿，平行2份（计算平均菌数：,A),回收率=(,AB),C,%,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,培养基稀释法可以是1,ml,供试液注2个、5个或更多个,平皿。但是更多的平皿由于操作繁琐易污染一般不做。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,回收率测定举例,供试液需用特殊制备方法（如加中和剂或乳化剂等),常规法,菌液组：,1,ml,菌液/平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平,均菌数：,C),供试品对照组：,最低稀释级供试液1,ml,/平皿，平行,2,个,平皿（计算供试液平均菌数：,B）,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,试验组：,最低稀释级供试液1,ml+1ml,菌液/平皿，平行2个,平皿（计算供试液平均菌数：,A）,稀释剂对照组：,稀释剂+加中和剂或乳化剂+,1ml,菌液，,平行2个平皿（计算供试液平均菌数：,D）,试验组回收率=(,AB)C%,稀释剂对照组回收率=,DC%,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,回收率测定举例,供试液需用特殊制备方法（如加中和剂或乳化剂等),培养基稀释法（5个平皿）,菌液组,：1,ml,菌液/平皿，每株菌平行2个平皿（计算平均,菌数：,C),供试品对照组,：,最低稀释级供试液1,ml,分别注5个平皿，,0.2,ml/,平皿，平行2份，共10个平皿（计算0.2,ml,供试液,平均菌数：,B）,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,试验组,：最低稀释级供试液0.2,ml+,+加中和剂或乳化剂,1ml,菌液/平皿，平行2个平皿（计算平均菌数：,A),试验组回收率=(,AB)C,%,稀释剂对照组,：稀释剂+加中和剂或乳化剂+,1ml,菌液，,平行2个平皿（稀释剂对照组与试验组同法操作）（计算,平均菌数：,D),稀释剂对照组回收率=,DC%,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,回收率测定举例,供试液需用特殊制备方法（离心沉淀法）,菌液组：,1,ml,菌液/平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平,均菌数：,C),供试品对照组：,最低稀释级供试液10,ml,+离心，500,rpm,离心取上清，加稀释剂至10,ml，,取1,ml,注平皿，平行,2,个平皿（计算平均菌数：,B),或3000,rpm,离心取沉淀，加稀,释剂至10,ml，,取1,ml,注平皿，平行,2,个平皿（计算平均,菌数：,B),细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,试验组：,最低稀释级供试液10,ml,+离心，500,rpm,离心取,上清，加稀释剂至10,ml，,取1,ml+1ml,菌液/平皿，平行,2,个平皿（计算平均菌数：,A),或3000,rpm,离心取沉淀，加稀,释剂至10,ml，,取1,ml+1ml,菌液/平皿，平行2个平皿（计算,平均菌数：,A),试验组回收率=(,AB),C,%,稀释剂对照组,：取与菌液组细菌浓度相同的稀释剂10,ml，,3000rpm,离心取沉淀，加稀释剂至10,ml，,取1,ml,注平皿，,平行2个平皿（计算平均菌数：,D),（稀释剂对照组与试验,组同法操作）,稀释剂对照组回收率=,D,C,%,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,回收率测定举例,试液需用特殊制备方法（薄膜过滤法）,菌液组：,1,ml,菌液/平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平,均菌数：,C),供试品对照组：,含1,g,或1,ml,的供试液，过滤冲洗，至少1,张膜（菌落计数：,B),试验组：,含1,g,或1,ml,的供试液，过滤冲洗，+1,ml,菌液，过,滤，至少1张膜（菌落计数：,A),稀释剂对照组：,稀释剂+菌液，过滤冲洗，至少1张膜,（菌落计数：,D),细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,过滤细菌的膜贴在预先倒好并预培养过的营养琼脂,培养基平板上，菌面朝上。,过滤霉菌酵母菌的膜贴在预先倒好并预培养过的玫,瑰红钠琼脂培养基平平板上，菌面朝上。,试验组回收率=(,AB),C,%,稀释基对照组回收率=,D,C,%,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,计数方法的确定,细菌计数方法与霉菌和酵母菌计数方法可以不一致。,细菌以各试验菌（,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯,草芽孢杆菌）,的回收率均能达到70%以上的检测方法为准。,霉菌和酵母菌以各试验菌（,白色念珠菌、黑曲霉）,的回收率均能达到70%以上的检测方法为准。,细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,计数方法的验证,结果判断,在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率,应均不低于70%。,若试验组的菌回收率均不低于70%，则按此供试液制,备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数能,保证检验结果的准确、可靠。,若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用,培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法,等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并,重新验证。,控制菌检查法的验证,试验菌株：,按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。,阴性对照菌株:,选择原则，口服选用金黄色葡萄球菌，外,用选用大肠埃希菌。,菌种的要求：,不得超过5代。采用适宜的方法保存。,加菌量:10100,cfu,控制菌检查法的验证,验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及,下列要求进行。,验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。,试验组：,取规定量供试液及10100,cfu,试验菌加入,增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查.,阴性菌对照组：,设立阴性菌对照组是为了验证该控,制菌检查方法的特异性，方法同试验组。,控制菌检查法的验证,控制菌检查验证用菌株：,大肠埃希菌、沙门菌、,金,黄色葡萄球菌,、,铜绿假单胞菌,、,生孢梭菌,。,控制菌检查法的验证,口服制剂,验证用菌株：,大肠埃希菌 大肠菌群 沙门菌,阴性对照菌菌株：,金黄色葡萄球菌,检查方法：,大肠埃希菌按大肠埃希菌项下检查,大肠菌群按大肠菌群项下检查,沙门菌按沙门菌项下检查,控制菌检查法的验证,外用制剂,验证用菌株：,铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 生孢梭菌,阴性对照菌菌株：,大肠埃希菌,检查方法：,铜绿假单胞菌,按,铜绿假单胞菌,项下检查,金黄色葡萄球菌,按,金黄色葡萄球菌,项下检查,生孢梭菌,按,生孢梭菌,项下检查,控制菌检查法的验证,验证方法选择：,常规法,、,稀释法,、,薄膜过滤法,、中和法、,离心沉淀法、联合方法。,供试品量：,1,g,或1,ml，,沙门菌检查为,10,g。,培养基：营,养肉汤培养基、胆盐乳糖增菌液、,MUG,培养基、,胆盐乳糖发酵管、,四硫磺酸盐增菌液,、,胆盐硫乳,琼脂平,板、麦康凯琼脂平板、,溴代十六烷三甲胺平板,、,甘露醇,氯化钠平板,、,0.1%,疱肉培养基,、,含,庆大霉素的哥伦比亚,琼脂平板。,控制菌检查法的验证,菌液制备,接种,大肠埃希菌、沙门菌、,金黄色葡萄球菌,、,铜绿,假单胞菌,、,生孢梭菌的新鲜培养物至10,ml,营养肉汤培养,基中，3537培养1824小时，取此培养液1,ml,加0.9,无菌氯化钠溶液9,ml，,采用10倍递增稀释法，稀释至,10,-5,10,-7,，使菌数约为10100,cfu/ml。,控制菌检查法的验证,常规法：,大肠埃希菌：,取相当于1,g,或1,ml,供试品的供试液至100,ml,胆盐乳糖增菌液，阳性菌对照加入,大肠埃希菌,10,100,cfu，,阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10,100,cfu,，,35,37培,养18,24小时，取此培养物0.2,ml,接种至含5,ml MUG培养,基的试管内培养，观察荧光及靛基质试验。阳性菌,MUG,阳性，靛基质阳性，则表明该样品对,大肠埃希菌没有抑,菌作用。,阴性菌未检出表明该控制菌检查方法的专属性,好。若阳性菌未检出则表明该样品对,大肠埃希菌有抑菌,作用，需对供试液进行处理。,控制菌检查法的验证,常规法,大肠菌群：,取含适量（不少于10,ml）,的胆盐乳糖发酵培,养基管3支，分别加入含供试品0.1,g,或,0.1ml、,0.01,g,或,0.01ml、0,.001,g,或,0.001ml,的供试液，,阳性菌对照加入,大,肠埃希菌,10,100,cfu,，,阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌,10,100,cfu,，,3537培养18,24小时观察结果。若阳性,菌检出而阴性菌未检出则表明该样品对大肠菌,群,无,抑菌,作用且专属,性好。若阳性菌未检出则表明该样品对,大肠,菌群有抑菌作用，需对供试液进行处理。,控制菌检查法的验证,常规法,沙门菌：,取供试品10,g,或10,ml,直接或处理后接种至适量,（不少于200,ml）,营养肉汤培养基中，混匀，阳性菌对照,加入,沙门菌,10100,cfu,，,阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌,10,100,cfu,，3537培养18,24小时，取此培养物1,ml,接种于10,ml,四硫磺酸盐增菌液，,培养18,24小时后划线于,胆盐硫乳,琼脂平板、麦康凯琼脂平板观察结果。若阳性,菌检出而阴性菌未检出则表明该样品对,沙门菌,无,抑菌作,用且专属,性好。若阳性菌未检出则表明该样品对,沙门菌,有抑菌作用，需对供试液进行处理。,控制菌检查法的验证,常规法,铜绿假单胞菌：,取相当于1,g,或1,ml,供试品的供试液至100,ml,胆盐乳糖增菌液,阳性菌对照加入铜绿假单胞菌10,100,cfu，,阴性菌对照加入,大肠埃希菌,10,100,cfu,，,3537培养18,24小时，取此培养物划线接种于,溴代十六烷三甲铵平板,观察结果。若阳性菌检出而阴性菌未检出则表明该样品对,铜绿假单胞菌无,抑菌作用且专属,性好。若阳性菌未检出则,表明该样品对铜绿假单胞菌,有抑菌作用，需对供试液进行,处理。,控制菌检查法的验证,常规法,金黄色葡萄球菌：,取相当于1,g,或1,ml,供试品的供试液至,100,ml,营养肉汤培养基,阳性菌对照加入金黄色葡萄球菌,10,100,cfu,，,阴性菌对照加入,大肠埃希菌,10,100,cfu,，,35,37培养18,24小时，取此培养物划线接种于,甘露醇氯,化钠平板,观察结果。若阳性菌检出而阴性菌未检出则表,明该样品对金黄色葡萄球菌无,抑菌作用且专属,性好。若,阳性菌未检出则表明该样品对金黄色葡萄球菌,有抑菌作,用，需对供试液进行处理。,控制菌检查法的验证,常规法,生孢梭菌：,取相当于1,g,或1,ml,供试品的供试液至1,00,ml,0.1%,疱肉培养基,阳性菌对照加入生孢梭菌10,100,cfu,阴,性菌对照加入,大肠埃希菌,10,100,cfu,，,3537厌氧培,养72,96小时，取0.2,ml,涂抹于含庆大霉素的哥伦比亚琼,脂平板,3,537,厌氧,4872,h,观察结果。若阳性菌检出而,阴性菌未检出则表明该样品对生孢梭菌无,抑菌作用且专,属,性好。若阳性菌未检出则表明该样品对生孢梭菌,有抑,菌作用，需对供试液进行处理。,控制菌检查法的验证,结果判断：,阴性菌对照组未检出阴性对照菌，试验组检出试验,菌，表明该法专属性强，可按此供试液制备法和控制,菌检查法进行供试品的该控制菌检查。,若试验组未检出试验菌，表明该供试品有抑菌作用，,应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法,等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并,重新验证。,控制菌检查法的验证,培养基稀释法：,供试品有抑菌作用，放大培养基量，由1：100放大,为1：300、1：500或1：1000。由于盛放培养基容器体积,有限，一般放大到500,ml,或1000,ml。,本法适用于抑菌作用,不强的中西药制剂，操作简便易行，应用范围广泛。,控制菌检查法的验证,薄膜过滤法：,采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，,试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基,或取出滤膜接入增菌培养基中。,控制菌检查法的验证,离心沉淀法：,取规定量供试液，如供试液含许多药渣先以低速,500,r/min,离心35,min，,取上清液，再以3000,r/min,离,心1030,min，,取下面1,ml,液体，并将适量的稀释剂洗涤,管底的洗涤液一并移入同瓶增菌液中，培养。本法适用,于中度抑菌作用的中西药制剂。,控制菌检查法的验证,中和法：,在供试品溶液中加入相应的中和剂，以减除供试品,中抑菌性成分的作用。中和剂应对微生物无毒性，与抑,菌成分结合后的产物应对微生物亦无毒性，或有毒性但,不影响待检菌的检出。,微生物限度检查方法的验证,中和剂,常见的有,(1)磺胺类药物:加入适当的对氨基苯甲酸,(2),含重金属的药物:在培养基中加入巯基化合物如硫乙醇酸钠-半胱氨酸,(3),洗必泰制剂:加入聚山梨酸80(3%)或卵磷脂(3%),(4),卤素:加入硫代硫酸钠(0.1%),微生物限度检查方法的验证（举例）,谢谢,