预防兽医常用实验室技术专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,HA,和,HI,试验,-5-10,预防兽医常用实验室技术专家讲座,第1页,二、试验原理,病毒红细胞凝集现象：,许多病毒表面有血凝素，能与各种动物红细胞表面受体结合，从而出现红细胞凝集现象，,简称为病毒血凝现象。,有血凝特征病毒：,AIV,、,NDV,、狂犬病毒、犬细心病毒、鸡产蛋下降综合症病毒等。,试验原理,预防兽医常用实验室技术专家讲座,第2页,试验材料,抗凝剂、,PBS,、,96,孔,V,型微量反应板、,1%,红细胞悬液、微量移液器、微量振荡器等。,预防兽医常用实验室技术专家讲座,第3页,红细胞悬液制备病毒红细胞凝集试验（,HA,）,病毒红细胞凝集抑制试验（,HI,）,试验内容,预防兽医常用实验室技术专家讲座,第4页,鸡红细胞悬液制备,用注射器无菌抽取健康,非免疫鸡,静脉血，与抗凝剂等量混匀。,加生理盐水或,PBS,适量，洗涤离心，共离心三次：第一、二次,1000 rpm,10min,、第三次,1200rpm,10min,。目标为洗去血清及白细胞，预防红细胞溶血。（红细胞洗涤过程最好在,4,进行,）,所余纯红细胞，用生理盐水或,PBS,稀释,100,倍，即成,1%,鸡红细胞悬液，放置于,4,备用。,预防兽医常用实验室技术专家讲座,第5页,HA,试验,先将待检病毒材料稀释成不一样稀释倍数，再加入,1%,鸡红细胞，混匀，,4,静置后观察结果。在出现血凝现象各稀释孔中，能使红细胞出现完全凝集病毒最大稀释倍数即定为病毒凝集价。又称为该病毒血凝滴度。,判定标准：,（）凝集反应者，凝集红细胞呈薄膜状，均匀铺满孔底。,（）红细胞全部沉于孔底中央，周围无散在红细胞。,预防兽医常用实验室技术专家讲座,第6页,孔号,1,2,3,.,10,11,对照,病毒稀释倍数,2,1,2,2,2,3,.,2,10,2,11,（,1,）,生理盐水或,PBS,25,25,25,.,25,25,25,（,2,）病毒,25,25,25,.,25,25,弃去,25,（,3,）生理盐水或,PBS,25,25,25,.,2525,25,（,4,）,1%,红细胞悬液,25,25,25,.,25,25,25,振荡混匀，,4,或室温温箱作用，,10,分钟开始观察，直到结果出现。,HA,试验步骤,预防兽医常用实验室技术专家讲座,第7页,病毒红细胞凝集抑制试验（,HI,）,（,1,）凝集抑制价含义及判定,（,2,）,4,单位病毒配制,（,3,）,HI,试验与步骤,预防兽医常用实验室技术专家讲座,第8页,凝集抑制价含义及判定标准,HI,试验,：病毒红细胞凝集现象，能够被特异性免疫血清所抑制，称,HI,试验。,抗体效价：出现红细胞凝集完全抑制现象血清最大稀释倍数叫抗体效价，又称该,血清,HI,滴度,。,判定标准：,（,+,）即出现红细胞凝集被抑制者，红细胞全部沉于孔底中央，周围无散在红细胞。,（,）凝集红细胞呈薄膜状，均匀覆满孔底，有似有红细胞沉积于中央。,预防兽医常用实验室技术专家讲座,第9页,4,单位病毒配制,1,单位病毒,将病毒按其血凝滴度进行稀释后所得病毒液为,1,单位病毒。,4,单位病毒,即将一个血凝单位病毒增加至,4,倍浓度，比如一个血凝单位为,1:64,，,4,个血凝单位则为,64/4=16,倍稀释。,注意：,4,单位病毒配制好后，还需要进行,HA,试验验证，测定其血凝价是否为,4,，而后再进行下一步试验。,预防兽医常用实验室技术专家讲座,第10页,孔号,1,2,3,.,10,对照,对照,血清稀释倍数,2,1,2,2,2,3,.,2,10,（,1,）生理盐水或,PBS,25,25,25,.,25,25,25,（,2,）血清,25,25,25,.,25,弃去,25,（,3,）,4,单位病毒,25,25,25,.,25,25,25,PBS,振荡混匀，室温或,37,温箱,15-30,分钟,（,4,）,1%,红细胞悬液,25,25,25,.,25,25,25,振荡混匀，室温或,4,温箱作用，,10,分钟后开始观察，直到结果出现,HI,试验与步骤,预防兽医常用实验室技术专家讲座,第11页,病毒灭活,灭活是指用物理或化学伎俩杀死,病毒,、,细菌,等，不过不损害它们体内有用,抗原,方法。,病毒灭活,会使病毒蛋白高级结构受到破坏，蛋白不再有生理活性，所以失去感染，致病和繁殖能力，不过常规灭活不影响病毒蛋白一级结构，所以,灭活病毒含有抗原性，但失去感染力。,预防兽医常用实验室技术专家讲座,第12页,病毒灭活方法,化学消毒剂法（如次氯酸钠）,胃蛋白酶处理法,热处理法：干热法（,80,，,72h,），蒸汽加热（,60,，,10h,），巴斯德加热处理法,有机溶剂或去污剂处理法（如甲醛、吐温,80,）,低,PH,孵育法,紫外线照射处理法,预防兽医常用实验室技术专家讲座,第13页,病毒灭活确实证,因为制品组成、稳定剂及其浓度不一样，均会对灭活病毒效果有一定影响。所以在灭活病毒后必须进行病毒灭活效果验证。验证方法包含：蚀斑形成、细胞病变（如合胞体或病灶形成）、终点滴定或其它方法。这些方法应该有适宜灵敏度和可重复性，每一个取样点应取双份样品并设有对照以确保结果准确性。,预防兽医常用实验室技术专家讲座,第14页,流感病毒甲醛灭活法,原理：甲醛使微生物蛋白质、核酸变性，造成微生物死亡，但不显著影响其免疫原性。,步骤：将甲醛（市售普通在,37,）用,PBS,稀释到,50,倍。然后稀释后甲醛与尿囊液以,7,：,43,百分比混合（注：甲醛应迟缓滴加到病毒尿囊液中，边摇动边加入）。甲醛加入后，将尿囊液置于,4,灭活,12h,，每隔,2h,摇动一次。而后，置,37,摇床内继续灭活,12h,，就能够完全灭活。,会,使原来病毒效价降低,12,个滴度。,验证：将灭活后病毒液接取样接种,10,日龄鸡胚，观察鸡胚是否死亡？是否有,HA,效价？,预防兽医常用实验室技术专家讲座,第15页,