分子生物学---第5章-原核生物的转录.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Molecular Biology Course,第六章,原核生物的转录,(,Transcription in prokaryotes),教学要求,掌握一些基本概念,:,转录的不对称性,有义链,反义链,转录单元,掌握大肠杆菌,RNA,聚合酶的组成及各部分的功能,理解大肠杆菌,因子尤其是,70,的功能和识别序列,掌握原核生物转录的过程,第1节 转录的基本原则,第2节 大肠杆菌RNA聚合酶,第3节 大肠杆菌,70,启动子,第4节 转录过程,主要内容,Molecular Biology Course,第1节,转录的基本原则,一、转录概述,二、,RNA合成的过程,1.转录(Transcription):,生物体以DNA为模板合成RNA的过程。,Transcription,RNA,DNA,一、转录概述,Central Dogma of molecular biology Information store in DNA flows:,From DNADNA(Replication),From DNA RNA(Transcription),From RNA Protein(Translation),Four types of RNA made,Messenger,RNA Most of the RNA in cells is found in ribosomes-our protein-synthesizing machines,The transfer RNA molecules used to add each new amino acid to growing proteins.,Small RNA molecules are involved in regulating,processing and disposing of the constant traffic of messenger RNA.,Messenger RNA,Transfer RNA,Ribosomal RNA,Small Nuclear RNA(eukaryotes),2.转录所需的物质,The precursor ribonucleotides(前体核糖核酸):NTP(ATP,UTP,GTP,CTP),Template(模板):DNA,Enzyme(酶):RNA polymerase,(RNA-pol),RNA聚合酶,Other protein factors,RNA is transcribed 5,3,5,3,3,5,Template strand,Coding strand,Coding strand,Template strand,Structural gene,Direction of transcription,Direction of transcription,4.Asymmetric transcription(不对称转录),DNA,链上只有部分的区段作为转录模板,(,反义链或模板链,),且模板链并非自始至终位于同一股,DNA,单链上，称为转录的不对称性。,5.transcription unit（转录单元）,一段从启动子开始至终止子结束的,DNA,序列。,包括上游调控区、结构基因区、下游转录终止区三个部分。,原核生物的转录单位多为 多顺反子,真核生物中的转录单位多为单顺反子。,转录起点即转录原点记为,1,，其上游记为负值，下游记为正值。,Promoter,Terminator,Transcribed region,Sense strand,Antisense strand,DNA,RNA,Transcription,+1,Structure of a typical transcription unit,Is transcribed region equal to coding region?Why?,单林娜 制作,15,lac,I,Regulatory gene,lacZ,lacY,lacA,DNA,m-RNA,-Galactosidase,Permease,Transacetylase,Protein,Structural Genes,P,lac,I,Plac,O,lac,6.转录,与复制的比较,相同点的：,Template:DNA,底物,:nucleotide,Direction:53,DNA-dependent polymerase,依赖,DNA,的聚合酶,Watson-Crick base pairing,Product:polynucleotide chain,多聚核苷酸链,不同点,replication,transcription,模板,两股链均作为模板,模板链作为模板,原料,dNTP,NTP,聚合酶,DNA聚合酶,RNA聚合酶,产物,子代DNA双链,mRNA;tRNA;rRNA,配对,A-T；G-C,A-U；T-A；G-C,引物需RNA引物,-,方式(特点),半保留复制,不对称转录,二、,RNA合成的过程,RNA,聚合酶识别启动子,Initiation,起始,Elongation,延伸,Termination,终止,第2节,大肠杆菌RNA聚合酶,以DNA为模板合成单链RNA,Arthur Kornberg(left)with his son,Roger,after Roger received the Nobel Prize in Chemistry for 2006.Arthur Kornberg received the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1959Both father and son are faculty members at the Stanford University School of Medicine.,Kornbergs with the polymerases,There have got to be tens of thousands of people around the world today whose eyes are tearing up with the news that hes gone.,He was an extraordinary scientist.His accomplishments might be called legendary.,不需要引物,以,DNA,为模板,5,3,合成,需要,Mg,2+,没有,3,5,外切活性，核苷酸的错误掺入率为,10,-4,-10,-5,由多亚基构成的酶,一、RNA polymerase,以DNA为模板，催化2个游离的NTP形成3，5-磷酸二酯键,二、E.coli,RNA聚合酶,E.coli,只有一种,RNA,聚合酶，指导所有类型,RNA,的合成,最大的酶之一,全酶至少由,5,个亚基构成,2 alpha(,a,),and 1 of beta(,b,),beta prime(,b,),omega(,w,)and sigma(,s,),亚基,RNA,合成的速率,:,37,o,C,下,40,nt,/s,E.Coli,RNApol 的亚基组成,只用于起始,用于起始和延伸,Bacterial RNA polymerase,1.,亚基,由,rpoA,编码,核心酶的组建因子,促使,RNApol,与,DNA,模板链结合,前端,因子使模板,DNA,双链解链为单链,尾端,因子使解链的单链,DNA,重新聚合为双链,2,2,Bacterial RNA polymerase,b,由,rpoB,编码,b,由,rpoC,编码,.,RNA,聚合酶的催化中心,.,b,subunit,：,含有两个结构域分别负责转录的起始和延伸。,2.b,and,b,亚基,b,亚基结合两个锌离子，参与酶的催化功能。,负责酶与模板DNA相结合(充当SSB的作用)。,许多原核生物含有多个,s,因子，用于识别不同的启动子，,最常见的是,s,70,核心酶与,s,因子结合转变为全酶。,启动子识别中起着关键的作用,转录起始后，,s,factor,解离,(RNA chain is 9-10,nt,),细胞中,s,因子 比其他亚基少。,3.s,因子,E.coli中不同的,因子可识别不同的启动子,Gene,Factor Use Sequence,Separation Sequence,35,10,70,General,32,Heat shock,E,Heat shock,54,Nitrogen,F,flagellar,大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析,亚基,基因,相对分子量,亚基数,组分,功能,rpoA,36500,2,核心酶,核心酶组装，启动子识别,rpoB,151000,1,核心酶,和共同形成RNA合成的活性中心,rpoC,155000,1,核心酶,用于模板的结合,？,11000,1,核心酶,？,rpoD,70000,1,因子,存在多种,因子，用于,识别不同的启动子,Core,Enzyme,具有的四个功能位点,DNA/RNA 杂交位点(),D.S.DNA 解链位点(),D.S.DNA 重旋(),启动子识别位点,DNA无义链结合位点(),4.全酶（Holo Enzyme）功能,用于转录的起始和延伸,依靠空间结构与,DNA,模板结合,(,与核心酶结合后引起的构象变化,),专一性地与,DNA,序列,(,启动子,),结合,结合常数：,10,14,mol,转录效率低，速度缓慢（,的结合）,Bacterial RNA polymerase,5.核心酶（Core Enzyme）的功能,作用于转录的延伸过程（终止）,依靠静电引力与DNA模板结合（蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之 间）,非专一性的结合（与DNA的序列无关）,结合常数：10,11,mol,Bacterial RNA polymerase,T3 RNA聚合酶和 T7,RNA聚合酶,小分子,转录速度快,(200,nt,/sec),识别自身启动子,RNA polymerase differs from organism to organism,6.其他RNA聚合酶,第三节 大肠杆菌,s,70,启动子,一、,Promoter 启动子,二、promoter efficiency 启动子的效率,一、Promoter启动子,特异的短的保守序列,位于转录起始位点的上游，用负数表示。,是,RNA,聚合酶特异性结合和转录起始所必须的。,是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点。,Different promoters result in differing efficiencies of transcription initiation,which in turn regulate transcription.,Promoter,Terminator,Transcribed region,Sense strand,Antisense strand,DNA,RNA,Transcription,+1,-55 to+20:,全酶的结合,-20 to+20:,聚合酶紧密结合，防止,DNase,的降解,Up to position 40:,最重要,(mutagenesis analysis),-,10 and 35 sequence,:6 bp,对大肠杆菌基因的起始转录最关键,s,70,promoter,开始转录,T T G A C A,A A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,1,-30,-50,10,-10,-40,-20,5,3,3,5,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点,(recognition site),5,5,RNA聚合酶保护区,结构基因,3,3,-10,sequence(Pribonow box,，,Pribonow,框,),高度保守序列，位于,DNA,解旋开始的部位。,由,6,个碱基组成，其中心位于,-10,位置处，在许多不同的大肠杆菌基因启动子中都存在。,保守序列为,TATAAT,.,头两个碱基,(TA),和最后的碱基,T,高度保守。,与转录起始位点,(+1),之间的距离为,5-8,bp,。,其功能是:,(1)RNA pol紧密结合;,(2)形成开放启动复合体；,酶在此处与DNA结合成稳定的复合物，在转录方向上解开双链形成开放型起始结构。,(3)使RNA pol定向转录。,-,35 sequence(,Sextama盒,Sextama box),:,RNA聚合酶的起始识别区；,亚基识别-35序列，为转录选择模板,位于,-35,位置处的一个保守的六聚体序列,TTG,ACA,头三个碱基,(TTG),是高度保守的,与10 box,之间的距离为,16-19,bp,RNA,聚合酶的松弛（初始）结合位点,RNA,聚合酶依靠其,亚基识别该位点，,为转录选择模板,识别位点,重要性,:,很大程度上决定了启动子的强度,Transcription start site,转录起始位点,转录开始时模板上的第一个碱基，,90,基因的起始位点是嘌呤,G,比,A,普遍,(i.e.,C,G,T or C,A,T),在起始核苷酸的两侧是,C,和,T,大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区,T,85,T,83,G,81,A,61,C,69,A,52,T,89,A,89,T,50,A,65,A,100,二、promoter efficiency,启动子的效率,There is considerable variation in sequence between different promoters,and the transcription efficiency can vary by up to 1000-fold.,The 35 sequence,:,s,因子识别的区域,.,The-10 sequence,对,DNA,解旋起着重要的作用。,起始位点周围的序列影响起始效率。,最初转录的,30,个碱基控制着,RNA,聚合酶离开启动子，使另一聚合酶复合物重新起始转录的速率。,Some promoter sequence,are not sufficiently similar to the consensus sequence,to be strongly transcribed under normal condition,thus activating factor is required for efficient initiation.,Example:,Lac,promoter,P,lac,requires activating protein,cAMP,receptor protein,(CRP，环腺苷酸受体蛋白),to bind to a site on the DNA close to the promoter sequence in order to,enhance polymerase binding and transcription initiation.,Weak promoters and activating factor,第4节 转录过程,一、RNA链起始,二、RNA链延伸,三、RNA链终止,一、RNA链起始,Promoter binding,启动子结合,DNA unwinding DNA,解旋,RNA chain initiation RNA,链起始,1.,启动子的结合,寻找启动子的速度非常快,全酶与35序列结合，产生封闭的酶-启动子二元复合物,and 10 region,Link,核心酶,a,2,bb,w,与,DNA,的结合无特异的亲和性，结合非常松散,显著的增强全酶与正确启动子结合位点相结合的特异性,。,The role of,s,factor,in promoter binding,2.,DNA 解旋,全酶紧密地结合在-10序列处，模板DNA局部变性，形成开放的启动子二元复合体,+1,DNA解旋是必须的，使反义链通过碱基配对合成RNA。,Negative supercoiling enhances the transcription of many genes,，,since it facilitates(有利于)unwinding.Some promoters are not.,Exceptional example:,promters for the enzyme subunits of DNA gyrase(旋转酶),are inhibited by negative supercoiling,serving as an elegant feedback loop for DNA gyrase expression.,Negative supercoiling(,负超螺旋,)&unwinding,3.,RNA chain,起始,+1,酶移动到转录起始位点，第一个rNTP转录开始,因子释放,形成酶-启动子-rNTP三元复合体（ternary complex）。,Starts with a GTP or ATP,RNA polymerase holoenzyme,(+,s,factor),closed promoter complex(moderately stable),the sigma subunit binds to the-10 region,once initiation takes place,RNA polymerase does,not need very high affinity for the promoter,sigma factor dissociates from the core polymerase,after a few elongation reactions,elongation takes place with,the core RNA polymerase,open promoter complex(highly stable),the,holoenzyme,has very high affinity for,promoter regions because of sigma factor,s,sigma can re-bind,other core enzymes,The sigma cycle,s,s,起始过程：,RNA聚合酶全酶搜索并结合DNA特异位点,RNA聚合酶全酶接触DNA分子,通过接触-解离-再接触搜索启动子序列,闭和的启动子复合体,RNA,聚合酶（全酶）中的,因子,在,DNA,双链,上迅速、随机滑动，寻找到,启动子-35区,，形成,疏松的复合物，DNA双链未解开,。,开放的启动子复合体,RNA,聚合酶（全酶）,移向-10区和转录起始,点,在-20区DNA,双链解开12-17bp,时的启动子,复合体。,DNA-酶-底物NTP三元起始复合物的形成,在聚合酶全酶的作用下，聚合第一个磷酸二酯键以及连续的一小段新生RNA链。当RNA聚合酶聚合新生RNA链为910个核苷酸时，,因子脱离全酶，进入延伸阶段。,2,5,5,原核生物转录起始过程,二、,RNA chain,延伸,Transcription bubble(,转录泡,),1),亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿,3 5,方向前移；,2),在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,3),RNA-DNA形成,12bp,长的杂交螺旋,4),转录产物RNA沿,5,3,方向延长,单林娜 制作,61,7,启动子清除,:,起始成功后，,s,因子释放出来，形成一个由,RNA,聚合酶,-DNA-,新生的,RNA,组成的三聚体，核心酶向下游移动离开启动子。,Transcription bubble:,(,转录泡,),17,个核苷酸的,DNA,形成解链区，产物,RNA,链大约有,12,个核苷酸与模板形成,RNA-DNA,杂合双链,RNA,聚合酶,沿着,DNA,链移动，在转录泡之间解开双螺旋，在转录泡之后形成双螺旋。,The,E.coli,polymerase moves at an average rate of 40,nt,per sec,depending on the local DNA sequence.,Transcription bubble,三、,转录的终止,Transcription termination of Prokaryotic,RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,(一)、终止子的种类,二)、原核生物转录的终止,Transcription termination of Prokaryotic,(一)、终止子的种类,1、不依赖,因子的终止子/内在终止子,(rho-independent terminators/intrinsic terminators),体外实验中，只有核心酶和终止子就足以使转录终止。,2、依赖,因子的终止子,(rho-dependent terminators),蛋白质辅助因子,因子,存在时，核心酶终止转录,两者有共同的结构特征（序列差异）,1、不依赖,因子的终止子(强终止子),结构特征:,一是形成一个发夹结构,茎.720 bp的IR(inverted repetition),序列形成（富含G/C）,环.中间不重复序列形成,发夹结构的突变可阻止转录的终止,二是6 8 个连续的U串(发夹结构末端),Transcription termination of Prokaryotic,“,Hairpin”,，发夹结构,Weak association,A:U base pairs are weaker than G:Cs.,使,RNA,聚合酶变构，转录停顿；,使转录复合物趋于解离，,RNA,产物释放。,2、依赖,因子的终止子,（1）结构,IR(inverted repetition)序列中的,GC,对含量较少;,发夹结构末端没有固定特征,（2）靠与,的共同作用而实现终止,Transcription termination of Prokaryotic,单林娜 制作,70,无连续 U串,G/C含量较少,1、不依赖,因子的终止子终止转录,（1）新生RNA链发夹结构形成,与RNApol发生作用,造成高度延宕（典型的有60秒左右）,阻止RNA链的释放,二、原核生物转录的终止,Transcription termination of Prokaryotic,（2）RNApol暂停为终止提供了机会，6 8个连续的U串可能为RNApol与模板的解离提供了信号,RNADNA之间的 rUdA 结合力较弱,于是：,RNADNA解离三元复合体解体,RNApol解离转录终止,Transcription termination of Prokaryotic,不依赖-因子的终止,DNA模板上有终止信号,转录出来的RNA,RNA聚合酶遇此结构,即停止工作。,DNA和RNA（dA：rU）,稳定性下降,GC富含和AT富含区的,回文结构,自身互补形成,发夹状结构（hairpin）,3尾端有,4个U,DNA恢复双链，,释放转录产物,不依赖因子的终止子终止转录,To next pic,.,2、依赖,因子的终止子终止转录,通读（read through）,：,因子的转录终止过程中，RNApol 转录了 IR 序列之后，虽发生一定时间的延宕，但如果没有 因子存在，则RNApol 会继续转录。,聚合酶能越过终止子继续转录称为通读。,Transcription termination of Prokaryotic,-因子的结构,六个亚基组成的蛋白质,ATP酶活性,与单链RNA结合,-因子的作用,与新生RNA结合,ATP供能,-因子沿,新生的RNA单链推进,新生的RNA单链,从DNA模板上分离下来,RNA Pol,转录DNA,因子附着到RNA,识别位点上,因子跟在RNAPol,后沿RNA移动,RNA Pol在终止位,点停下，并被,因,子追上,在转录泡中因子,使DNA-RNA杂种双,链解开,转录终止,释放出,RNA Pol,子,和 RNA,本章要点,一、基本概念,不对称转录、有意链、反义链、转录单元、启动子,二、大肠杆菌RNA聚合的结构及各亚基的功能,三、启动子的结构,四、大肠杆菌转录的过程,