无创产前技术课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,无创产前胎儿DNA检测技术简介,唐氏综合征,47,XY,+21,21-,三体综合征，又称先天愚型或,Down,综合征，是小儿最为常见的常染色体畸变疾病。我国活产婴儿中,21-,三体综合征的发生率约为,1/600,1/800,，男女之比为,32,，,60%,的患儿在胎儿早期即夭折流产。,传统产前诊断技术,胎儿细胞（fetal cell）,种类,滋养层细胞、胎儿有核红细胞、胎儿淋巴细胞、胎儿粒细胞,特点,包含完整的胎儿基因组可反映胎儿全部遗传信息,数目少，限制其应用于无创产前诊断,游离胎儿DNACell-free fetal(cff)DNA,Dennis Lo,卢煜明,特点：,1,含量是孕妇血液中胎儿细胞,DNA,的,970,倍,2,含量有一定的变化规律，妊,娠第,5,周开始可以检测出胎儿,游离,DNA,，随着孕周增加而,增加，存在个体差异,3,分娩后短时间内消失，平均,半衰期为,16.3min,（,4-30min,），,2h,后没法检出。,ChrN:100,Chr21:100,理论模型,正常胎儿,21,三体胎儿,Description of the contents,正常胎儿,Chr11:2000,Chr21:2000,1000,基因等分,/ml,（含,50,等份的胎儿基因,;950,等份的母亲基因）,ChrN:1900,Chr21:1900,ChrN:100,Chr21:150,母亲,21,三体胎儿,ChrN:2000,Chr21:2050,统计结果,:T21,正常胎儿,血浆,技术流程,末端修复,加“,A,”尾,接头连接,文库制备,（,1,天）,LM-PCR,上机测序,报告发送,数据分析,上机测序和数据分析,（,2,天）,C-bot,DNA,提取,血浆分离,样品处理,（,1,天）,血液采集,DNA,提取后质控,收样质控,文库质控,数据质控,结果审核,医院,血样寄送包装,4，1600g,10min,4，16000g,10min,残留细胞,取上清,样 品 处 理,两步法分离血浆,：80保存,DNA提取,使用微量样品基因组提取试剂盒(天根，DP316)进行血浆游离DNA提取,技术流程,末端修复,加“,A,”尾,接头连接,文库制备,（,1,天）,LM-PCR,上机测序,报告发送,数据分析,上机测序和数据分析,（,2,天）,C-bot,DNA,提取,血浆分离,样品处理,（,1,天）,血液采集,DNA,提取后质控,收样质控,文库质控,数据质控,结果审核,末端修复和加“,A,”,接头连接,T,DNA insert,+,PCR,P5,P7,Index,公用,P1,Index PCR primer,DNA insert,P5,P7,Index,SP1,SP2,Idx SP,P7,P5,PCR,扩增,在文库制备过程中，具有以下任意一条不合格的，判定为不合格文库：,(1),电泳检测后发现接头未连接；,(2),电泳检测或,2100,检测后发现存在接头污染；,(3)2100,检测后发现文库片段大小不合格,，,文库主峰大小为,290bp,左右，次峰大小为,450bp,左右；,(4),定量检测后，发现文库的浓度过低,(,浓度低于,30ng/ul),文库不合格标准,技术流程,末端修复,加“,A,”尾,接头连接,文库制备,（,1,天）,LM-PCR,上机测序,报告发送,数据分析,上机测序和数据分析,（,2,天）,C-bot,DNA,提取,血浆分离,样品处理,（,1,天）,血液采集,DNA,提取后质控,收样质控,文库质控,数据质控,结果审核,OH,Flow Cell,接头,diol,P7,P5,diol,diol,模板杂交,diol,diol,延长,diol,diol,变性,碱基片段杂交,剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，另外一端随机和附近的另外一个引物互补，被“固定”住，形成“桥”,(bridge)。,形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在芯片表面进行扩增，形成双链。,双链经变性成单链，再次形成桥，并作为下一轮扩增的模板继续扩增反应。,反复若干轮扩增，每个单分子得到了大量扩增，成为单克隆“,DNA,簇群”。,diol,diol,1,st,cycle,变性,1,st,cycle,退火,diol,diol,1,st,cycle,延长,diol,diol,diol,diol,2,nd,cycle,变性,2,nd,cycle,退火,diol,diol,diol,diol,diol,diol,2,nd,cycle,延长,n=35,总数,碱基片段扩增成簇,C,A,G,T,C,A,T,C,A,C,C,T,A,G,C,G,T,A,5,G,T,C,A,G,T,C,A,G,T,C,A,G,T,3,5,First base incorporated,Cycle 1:Add sequencing reagents,Detect Signal,Cleave Terminator and Dye,Cycle 2-n:Add sequencing reagents and repeat,边合成边测序原理,可逆阻断技术,Base Calling,1,2,3,7,8,9,4,5,6,T T T T T T T,G,T,T,G,C,T,A,C,G,A,T,HiSeq 2500,概况,PE,SBS,A,SBS,B,注射泵,试剂舱,光学控件,Flow cell,舱盖,鼠标键盘,试剂舱与样品舱,PE,试剂吸管,把手,2,个样品孔，同时上机,2,个文库,3,个试剂架,2,个,SBS,架,1 PE,架,Raising reagent rack sippers,PE,SBS A,SBS B,HiSeq 2500,试剂,测序试剂,安装约,15 minutes,每次使用需更换试剂瓶盖,试剂,舱恒温,Flow Cell,平台,Flow cells,用真空吸附,LED,显示真空吸附,FC,的情况,把手,Gasket,面积更大,双边面,设计,(8lane),增加了,5,倍面积,保留,8 lane,设计,25mm,宽,X 75mm,长,Lanes 1.7 mm,宽,只适用于,cBot,Flow Cell,的设计,双面使用,更快 的成像,线扫描,Time Delay Integration(TDI),成像系统,对,flow cell,的两个表面,clusters,进行扫描,更大的测序通量输出,成像,4 CCD cameras,4,个碱基图像同时捕获,先扫描上表面,(all 4 colors),再扫描下表面,(all 4 colors),A,T,C,G,Flow Cell,线扫描,Swath,把一个,l,a,ne,的一半定义为一个,swath,Cameras operate in TDI,不间断的输出图像,swaths,y,Flow Cell Swath/Tile,Flow Cell,Swath,Tile,HiSeq Control Software(HCS),把,1,个,swath,划分为,8,个部分,(tiles),HiSeq Control Software(HCS),操作界面更加简单的操作,Step-by-step run set up,人性化的,recipe,实时监控,试剂跟踪,帮助菜单,HiSeq Control Software(HCS),HCS,应用于整个,RUN,的流程,:,建立,RUN,的信息及参数,进行测序,对整个,RUN,进行监控,对一些操作步骤进行提醒,(e.g.,安装试剂,FC,priming,wash),测序准备工作,建立测序信息,进行测序,(run),对整个,RUN,监控,HCS,操作界面,First Base,报告,若在操作界面上选取了,Confirm First Base,就会弹出,First Base,报告进行这个,RUN,的初步评判,Option selected during Run Configuration,HiSeq 2500 HCS,软件,HCS,软件初步数据分析结果,HiSeq 2500HCS,软件,一个,RUN,的,Images Thumbnail,概况,HiSeq 2500,数据分析,A Simple,Familiar Workflow,HiSeq CONTROL SOFTWARE,Read Generation,images,intensities,base calling,alignment,biologically meaningful results,CASAVA,Alignments,variations,builds,VISUALIZATION,GenomeStudio,or,favorite browser,基因信息分析,通过,alignment,(,比对,),获得,所测得的每条序列的位置信息,.,依据这些位置信息,我们可以把每条序列定位到相应的染色体上,.,统计所有的序列分布情况,我们就可以获得分布在每条染色体上的序列条数,.,T21,样品分布在,21,号染色体上的序列条数比正常,eupoid,（二倍体）的样品的多,.,通过统计学上的检验,我们可以依据多的量检出,T21,或其它染色体非整倍性变异,.,样品,类型,质量,等级,预期密度,(k/mm2),产量标准,(M reads),质量标准,PF%,Q20(%),Q30(%),产前,(50 cycles),优秀,500,200,90,=95,=90,合格,330,150,85,=85,=80,原始数据质量标准,下机数据质控,格式转化后，统计每个,reads,长度，将大于,50bp,长度的,reads,截短至,50bp,，将不足,50bp,长度的,reads,舍去。其后，对每一个样品的,reads,数据进行质控，统计每个样本的数据量，将原始数据量小于,300M,的样本标记。同时分析,reads,的质量值和,GC,值是否有偏差，并画出图谱。,过滤数据质控,过滤原始数据后，若舍去数据在,10%,以上，通常表明下机数据质量偏差。此时，可再次对每一个样品的,clean reads,进行质控，画出,reads,的质量值和,GC,图谱，分析,clean reads,的质量值是否有所提高，,GC,是否趋向稳定等等。若过滤后这些值依然偏差，则可考虑数据重测。,比对数据质控,数据比对后，统计所有完全比对到基因组上唯一位置的,reads,数所占,clean reads,的比率，若比值小于,50%,，需分析原因，必要时考虑数据重测。,Z,值结果质控,对所有染色体的,Z,值进行统计，若,Z,值总和大于,50,并且单个染色体最大,Z,值小于,6,，标记为“,Unqualified sample suspicion,”。分析原因，必要时考虑数据重测。,谢谢！,