实时荧光定量PCR技术的原理及应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实时荧光定量,PCR,技术的原理及应用,(Real time Quantitative PCR),提纲：,实时荧光定量,PCR,原理,数学原理,化学原理,实时荧光定量,PCR,的,方法应用,绝对定量,相对定量,定量,PCR,的,实验要素,平台定量,PCR,仪器介绍,实时荧光定量,PCR,定义,：,在,PCR,反应体系中加入,荧光基团,，利用荧光信号累积实现了,实时监测,整个,PCR,进程，对,起始模板,进行定量分析的方法。,与普通,PCR,的区别,普通,PCR,技术：,在,PCR,结束后对,终点产物,进行定量分析。,实时定量,PCR,技术：,实时检测,PCR,扩增，在扩增的,指数期,对起,始模板进行定量。,定量,PCR,的数学原理,斜率与扩增效率,荧光定量,PCR,化学原理,非特异性荧光标记：,1,、,SYBR Green,特异性荧光标记：,2,、,TaqMan,1,、,SYBR Green,法,SYBR Green,熔解曲线分析,SYBR Green,法优缺点,优点,:,对,DNA,模板没有选择性,适用于任何,DNA,使用方便,-,不必设计复杂探针,非常灵敏,便宜,2,、,TaqMan,探针法,TaqMan,作用机理,TaqMan,法优缺点,Real-time PCR,方法应用,绝对定量,(Absolute Quantification,，,AQ),病原体检测,转基因食品检测,基因表达研究,相对定量,(Relative Quantification,，,RQ),基因在不同组织中的表达差异,药物疗效考核,耐药性研究,绝对定量与相对定量的定义,绝对定量通过标准品定量,绝对定量的标准样品：,已知拷贝数的质粒,DNA,，做系列稀释。,标准样品的种类：,含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒,含有和待测样品相同扩增片段的,cDNA,PCR,的产物,绝对定量：从荧光到拷贝数,相对定量通过内标定量,内标（,Endogenous Control,）通常是,-actin,、,GAPDH,基因等看家基因,在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小,内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,相对定量：参照因子,Calibrator,相对定量分析方法,1,-Ct,前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近,100,且偏 差在,5,以内,1,、用内参基因的,CT,值归一目标基因的,CT,值：,CT,（,test)=CT,（,target,test)-CT,（,ref,test),CT,（,calibrator)=CT,（,target,calibrator)-CT,（,ref,calibrator),2,、用校准样本的,CT,值归一试验样本的,CT,值：,CT=CT,（,test)-CT,（,calibrator),3,、计算表达水平比率：,2 CT=,表达量的比值,相对定量分析方法,2,：,双标准曲线法,目标基因与内参基因扩增效率不同,待测样品目的基因浓度,待测样品内参基因浓度,F=,对照样品目的基因浓度,对照样品内参基因浓度,定量,PCR,的实验要素,样品,DNA,纯度：,OD260/OD280=1.8,，,1.6 2.0,之间,DNA,用量：,0.05 ng 100 ng,RNA,纯度：,OD260/OD280=2.0,cDNA,用量：,1-100 ng,总,RNA,反转录的cDNA,取,1 uL,标准品,标准品梯度稀释方法,复管测试,样品和标准品都要重复,重复次数须遵循统计学要求,平台,PCR,仪介绍,ABI 7500 fast,特征：,使用,96,孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观,ABI,试剂,ROX,校正物理方面的误差：枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）,Rn=Normalization=Reporter/Referenc,Rotor gene 6500HRM,特征：,36,孔,(,普通透明,0.2mlPCR,管,),或者,72,孔,(,特殊,0.1ml,管,),离心式检测,可以做,HRM,。,MJ Opticon 2,特征：,可以使用,8,连排管或,96,孔板，软件操作简单,谢谢！,