实用-第4次课.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三节透射电镜的性能与应用,一、透射电镜的性能,.,透射电镜是以电子束作为照明光源的,.,装有聚光镜、物镜、中间镜、投影镜一系列电,磁透镜,.,其分辨率可达,0.1,0.2nm,.,放大倍数可达,100,万左右,.,电子散射的因素在其成像反差中起主导作用,.,在放大,500,倍时焦点深度为,500,m,.,图像用荧光屏显示，且无色彩,.,适于,1OOnm,的超薄切片以及复型膜等,.,要求样品在真空条件下成像,二、适用于透射电镜的样品,.,从样品的类别上分：,观察超薄切片,冷冻蚀刻的复型膜,悬浮样品的滴片,直接培养在载网上的,经过抽提处理的单层细胞,所以说透射电镜应用十分广泛,.,从研究内容上分,：,对细胞质膜或细胞质中的某些细胞器上的抗原,(,或抗体,),进行免疫标记,追踪细胞中某些大分子的放射自显影标记,对细胞申的某些生化成分作定位、定性、甚至定量的研究,制备细胞内微区元素定性和定量分析的样品,一般需先制备超薄切片，再分别做特殊的处理，所以这类样品都可用透射电镜来观察,专门研究细胞的超微结构，如,:,研究细胞质膜、细胞内膜系统中的某种细胞器或中心粒和细胞连接装置等，就更需用透射电镜了,透射电镜的操作程序,（）接通高压开关,（）加灯丝电流,（）电子枪的对中（和轴）,.,开机（启动）,.,电子束的获得与对中,.,照明系统的调节,（）聚光镜和轴,（）聚光镜光阑的选择与对中,（）聚光镜消像散,.,成像系统调节,（）物镜电子束移动补偿,（）物镜和轴的调整,（）中间镜、投影镜的调整,（）物镜像散校正,.,像观察和记录,（）低倍下检查,样品,（）正常观察,（）像记录,.,停机,三、透射电镜的操作程序,.,开机（启动）,启动的目的在于开动真空泵、接通各种电源，使其预热并达到稳定状态；预抽镜筒，直到镜筒各部分达到高真空状态。,（）合上总电源开关，使仪器与总电源接通。,（）打开冷却水阀门,(,或循环水电源,),。,（）检查各开关，旋钮是否在正确位置，然后打开仪器启动开关，这时仪器逐级抽低真空和高真空，直到完成,10,-,Torr,以上的真空度。准备,(,操作,),灯亮。共计约,30,40,分钟。,.,电子束的获得与对中,（）接通高压开关,在选择高压时，灯丝控制钮必须关闭或在最低位置，这样可以防止由于突然产生电压脉冲而引起灯丝或样品损坏，按下高压钮后要注意观察束流表，由于电子枪内有脏物会发生微放电或电晕现象，放电时会释放出镜筒吸附的残余气体，所以束流表会大幅度摆动，这个过程叫电子枪自清洁,。,选择电压值愈高，电子枪自清洁和达到稳定所需要的时间愈长。一般选择高压时，要选用比所用高压更高一档的电压值，用这一档使电子枪自清洁，然后再回到所需用的高压一档，这样电子枪能得到很好时稳定，只有在完全稳定以后才能进行下步操作。,（）加灯丝电流,在高压稳定以后，开始加灯丝电流，慢慢增加灯丝电压，一开始束流表几乎不动，当开始发射时，束流表指示上升很快，直到荧光屏上亮度和束流达到最大时，再增加灯丝电压束流也不增加为止。这个位置即是灯丝的饱和点。注意缓慢转动旋钮，切不可将灯丝电压加得过高，否则将会大大缩短灯丝寿命。,（）电子枪的对中（和轴）,当慢慢增加束流时，荧光屏反而变暗，这时就要调节电子枪合轴钮，使荧光屏亮度增加到最大。再增大束流若再变暗则再调整电子枪倾斜合轴钮，直至亮度最大为止。,每次接通电子枪,改变高压或更换样品,或其他原因关去灯丝重新加热时，都要重新检查调整灯丝饱和点，以保证灯丝寿命。照明系统的调节,（）聚光镜和轴,目的是为了使聚光镜光轴与电子枪发射的电子束合轴。当聚光镜会聚的光斑与光轴偏离时，在荧光屏上会造成照明明显不均匀，因此需要合抽。合轴的方法是改变光斑尺寸，即调节第一聚光镜电流。同时用第二聚光镜聚焦。若发现原来已对中好的光斑偏离屏中心，就是由于聚光镜与电子枪对中不好，可用机械装置或电控制的合轴线圈对中。此操作反复进行直至光斑不偏离中心为止。,（）聚光镜光阑的选择与对中,第二聚光镜中设有一多孔的活动光阑，根据需要选择恰当的光阑孔，以改变照明角。一般厚的样品选用大孔，需要反差大的薄样品、易被电子束损伤的样品选用小孔。通常用,m,光阑。光阑插入后要进行光阑孔与透镜对中合轴，改变第二聚光镜电流，在焦点两边。光斑应在屏中心均匀地伸缩，若偏心变动应调整光阑,X,、,Y/,方向的调节钮进行校正,（）聚光镜消像散,在双聚光镜系统中第一聚光镜是一个弱透镜，像散较大。当第二聚光镜聚焦时，在焦点前后光斑呈椭圆形变化，这就是聚光镜像散，它会减弱照明束亮度，并使成像不均匀。聚光镜消像散一般用消像散器调节，方法有三种：,a.,使聚焦光斑变圆：即调节第二聚光镜电流，在焦点前后变化同时调整消像散器，使椭圆形光斑变圆。,b.,使欠热灯丝像图形清晰,：,即在第二聚光镜聚焦时，减小灯丝加热电流形成灯丝像，然后调整消像散器使灯丝像中的拉线最清晰为止，这时将灯置饱和位置，光斑应呈圆形，如仍为椭圆形则说明光阑污染了。,c.,使聚光镜焦散图变圆,：,退出聚光镜光阑，聚焦光斑时将得到一焦散图。,调正消像散器和第二聚光镜电流出现最小像散为止，这方法比较精确，但不能消除光阑带来的像散，同时需要退出光阑。所以通常只用,a,或,b,，,高分辨时才用,c,，,并要求尽快操作才好。,.,成像系统调节,（）物镜电子束移动补偿,（）物镜和轴的调整,（）中间镜、投影镜的调整,（）物镜像散校正,.,像观察和记录,电镜调整完毕即可进行对样品的观察和记录。装样品的方法因各仪器不同而异，但在样品装入样品室之前，都必须将束流和高压关掉，以防止错误操作而引起高压放电和使灯丝寿命缩短。,（）低倍下检查样品,观察超薄切片先在低倍下,(200,倍左右）检查整个载网，选择优良的切片。其步骤如下：充分散焦第二聚光镜，退出物镜光阑，选择低放大倍率钮，利用申间镜电流聚焦，把选择好的网孔置于屏中央。,（）正常观察,a.,选择适当的放大倍率,一般认为人眼的分辨本领在,25cm,距离时是,0.1,0.25mm,左右，所以选择,1000,倍肘，能分辨,2500A,；,l0000,倍时，可分辨,250A,。,一般电镜拍照时总是降低一些倍率，然后在光学放大时再放大，如果要求分辨,25A,，,可以电子光学放大,5,万倍，光学放大,2,倍，或电子光学,1,万倍，光学放大,10,倍。,b.,聚焦,判断聚焦是否精确通常采用,“,像摇摆法,”,和,“,费涅尔条纹法,，放大,5,万倍以下用像摇摆法。在,5,万倍以上时应用费涅尔纹法。有时反差不好，不易正确聚焦，可采用,“,通过焦点法,”,来摄影，从稍过焦至久焦逐档摄影六张，从中择优使用。,5,万倍以下照像可运用,最佳欠焦,开关进行。聚焦以后，在拍照以前要求仔细地检查像的样品漂移、像散、畸变和倍率色差。,（）像记录,一般底片放入电镜之前要求预抽真空，半小时以后才能进入镜筒，以保证镜筒不被污染。电镜样品由于受电子束照射后，会不断缓慢地损坏，所以一般在选择好视野以后，应先进行照像，然后再仔细地观察。照像时一般先选好曝光时间，然后调整亮度，当正确曝光指示灯亮时即可曝光。照像以后要做好记录，以便事后查找。,.,停机,工作完毕时，先降低放大倍率，减暗荧光屏亮度，再按以下程序停机：,（）使灯丝束流处于零位，关闭灯丝和高压,（）切断镜筒电源，即停机按钮,（）,10,20,分钟后关闭总电源和循环水阀门,样品,入射电子束,背散射电子,二次电子,俄歇电子,扫描电镜,小角度弹性散射电子,非弹性散射电子,透射电子,透射电镜,非弹性散射电子,大角度弹性散射电子,扫描透射电镜,吸收电流,阴极荧光,连续,X,射线,特征,X,射线,X,射线能谱分析,