1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物测定分析方法如何进行验证,验证,验证就是证明采用的方法适合于相应检测要求，具有相当的准确性和可靠性，进而可以达到控制产品质量的目的。,生物制品检测方法,生物制品质控中采用的方法包括理化分析方法和生物学测定方法。,生物制品的理化分析方法验证原则与化学药品相同.,本课件仅对生物测定方法验证进行讨论,生物测定方法,生物学测定系指采用生物学方法，以反映被测物的生物学特性为目的的测定方法。,常见的生物学测定方法:,酶反应试验,结合试验,细胞测定试验,动物试验,生物测定方法,酶反应试验,是指在体外能促进酶分子的活
2、化或本身具备酶的活性，通过底物的变化检测酶活性。,这类方法的变异相对较小，结果比较准确。,试验结果的变化范围一般在520%之间。,生物测定方法,结合试验,是基于产品与某种物质的结合特性而设计的试验，如免疫结合试验。,目前主要用于生物制品的鉴别。,这类方法的变异也相对较小。,*结合试验中测定的分子不一定都具有生物活性,一般讲结合试验结果的变化范围在520%之间。,生物测定方法,细胞测定试验,是指产品可以诱导细胞产生可测定的应答，如细胞增殖、聚集、分化、死亡、迁移或产生特定的化学物质等。,细胞测定试验一般能较好地反映制品的生物学活性，常用于各种生物制品的活性（效力）测定。,相对而言,方法的变异较大
3、与使用传代细胞相比，使用原代细胞的方法变异更大。,通常细胞测定的结果变化在50%以上。（30%）,*精心操作以保证试验结果的一致性,生物测定方法,动物试验,是指以整体动物为试验材料检测制品生物学活性（或效力）的试验方法。,由于动物实验的成本高、周期长和变异大，所以一般仅用于成品检定。,更复杂并且包括动物的饲养、管理和维护。,一般测定一个药物的生物活性是通过与已知的标准品或未处理（未免疫）的动物进行比较而得。,方法的变异一般相对较大,通常动物试验的测定结果变化在50%以上。,生物测定法验证内容,生物测定方法验证内容.doc,耐受性验证项目，由于生物测定的持续性、复杂性以及参考品与样品贮存时间较
4、长的特点,可能需要考虑：,试验顺序的影响：测定在一个较复杂的试验中，由于它们相对于对照品的测定时间不同,测定顺序对试验参数的影响。,冻融稳定性的影响：将样品反复冻融，以确定对检测结果的影响。,批间的精密性：测定不同批细胞、血清、或其他具有较高变动性的物质对测定方法的影响。,生物测定法验证,目前我们的成品分析方法均为法定方法.,在被确定为法定方法前已经过了适当的验证。,企业使用前需进行转移性验证,以证实在企业实验室条件与实际的使用条件下该方法也是适用的。,方法转移验证的内容,EU,要求：至少是系统适应性、专属性,（目前有增加内容和项目的趋势）。,FDA,要求：系统适应性、专属性、定量限、检测限、
5、中间精密度。,中国：,不知道？,专属性、精密度,专属性如何验证,生物学测定方法的专属性与测定方法及产品组成密切相关，所以应首先从测试原理、测试用材料和供试品组成等方面分析方法的专属性。,CHO细胞残留，采用ELISA法，确认抗体的特异性及目标蛋白的非干扰性。,如何进行？,采用CHO蛋白标准品作为样品测试。（标准品浓度应选择质量标准限度左右的浓度）阳性结果,选用产品（目标蛋白）作为样品测试。（浓度应选择日常测试中的最大浓度，即范围的上限）阴性结果,用产品加CHO蛋白标准品测试。应阳性结果。,应有重现性，至少3个测试结果。,专属性如何验证,SDS-PAGE电泳纯度,检测目的，目标蛋白的纯度,验证方
6、法：,采用37度或更高温度将产品降解，获得产品二聚体杂质,与未降解的产品同时做实验，对照，降解后产品检测结果明显出现杂质带。,此外，需考虑产品中可能存在的小分子蛋白杂质。,应有重现性，至少3次检测结果,中间精密度如何验证,步骤：准备3个不同稀释度的样品（测量范围内的高、中、低浓度）,在一组3次试验中对每个稀释度重复测定3次。,测定不同工作日之间的变化,测定不同批号的试验样品间的变化,测定不同实验员间的变化等等,计算每一试验每一浓度测定的平均值和标准偏差,计算试验间每一浓度的变异系数,检测限如何验证,对于生物测定，LOD就是能产生比空白对照液强的反馈的最低试样浓度。通常认为反馈是空白对照标准偏差的2-3倍时为较为满意的测定限度。下述以免疫测定OD值为例：,检测限如何验证-例子,目的：确定比空白对照高3个标准偏差的值,步骤：配制适宜浓度的标准样品,配制空白对照液,按照SOP进行至少3次测定，并至少做两个平行,测定样品和空白的OD值,计算空白对照间的标准偏差,LOD=3*空白的标准偏差/（样品的OD值/样品浓度）,定量限如何验证,应该不需要再重复一次了,你们可以告诉我答案,参考资料,FDA-生物分析方法验证指南,WHO-GMP指南第2卷-验证,中国-生物技术测定方法验证指导原则,讨论时间,（暂定20分钟）,培训效果评估,30分钟时间完成,看试卷,生物测定方法验证培训考核试题.doc,
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