登革热实验室检测课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,登革热实验室检测,云南省寄生虫病防治所,2014,年,10,月,概要,检测目的,检测对象,检测内容,实验室检测,复核检测,检测方法,样本采集、保存和运输,检测目的,及时发现、诊断病例。,病毒分型和溯源。,为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。,检测内容,实验室检测,登革热疑似病例发生所在地医院和,/,或县（市）疾控机构采集病例血清，检测登革病毒抗原、核酸或抗体。,登革热疑似病例实验室检测流程,检测内容,复核检测,送州,/,市,CDC,或云南省寄生虫病防治所的临床标本，抽样,30%,进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和,/,或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于,5,例，疫情少于,5,例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。,疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用,PCR,方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增,E,蛋白编码基因，完成序列分析。,实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行,IgM,、,IgG,抗体和,/,或中和抗体检测。,检测方法,病原学检测,主要适用于急性期血液标本。,1,、抗原检测：一般发病后5,天内血液标本,NS1,抗原检出率高。标本中检出,NS1,抗原可以确诊病毒感染，适用于现场快速检测，可用于早期诊断,2,、核酸检测：一般发病后,6,天内血液标本病毒核酸检出率高。在病人血清中检出病毒核酸，可确诊而且能够分型，可用于早期诊断，但核酸检测容易因污染而产生假阳性，因此要求严格分区操作,3,、病毒分离：一般发病后,5,天内血液标本病毒分离率较高。将标本接种于蚊源细胞（,C6/36,）或哺乳动物细胞（,BHK21,、,Vero,）进行分离培养，出现病变以后，用检测抗原或核酸的方法鉴定病毒。分离到登革病毒可以确诊，但其耗时长，不适于快速诊断。,酶联免疫法检测登革病毒,NS1,抗原,检测仪器设备和材料,加样器、温箱、洗板机、含波长,450nm,的酶标仪、登革病毒抗原检测试剂盒（酶联免疫法）,酶联免疫法检测登革病毒,NS1,抗原,结果判定,1,、临界值计算：临界值,=0.10+,阴性对照孔,A,值均值（阴性对照孔,A,值低于,0.05,者以,0.05,计算）。,2,、阴性对照的正常值范围：阴性对照孔,A0.1,（若,1,孔,A,大于,0.1,应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照大于,0.1,，应重复实验）。,3,、阳性对照正常值范围：,A0.8.,4,、阳性判定：样品,A,值临界值者为登革病毒抗原阳性。,5,、阴性判定：样品,A,值临界值者为登革病毒抗原阴性。,意义,结合临床信息，阳性结果可以诊断为登革病毒感染，但阴性结果并不排除登革病毒感染的可能。,胶体金免疫层析法检测登革病毒,NS1,抗原,结果判定,1,、阴性结果：仅质控线,C,出现肉眼可见条带。,2,、阳性结果：质控线,C,和检测线,T,均出现肉眼可见条带。,3,、无效结果：未肉眼可见的质控线,C,4,、质量控制：如遇下列情况，请按上述操作步骤使用实验室备用的阳性和阴性样本对该批产品进行质量控制：,4.1,、新检验员使用本产品。,4.2,、使用新批号产品。,4.3,、试剂卡储存温度在,2-30,以外。,4.4,、测试区温度在,2-30,以外。,9,意义,阳性结果说明检测到登革病毒抗原，结合临床可以诊断为登革病毒感染；,阴性结果说明没有检测到登革病毒抗原，但不能排除登革病毒感染。,NS1,快速诊断卡的使用,NS1,快速诊断卡的使用,NS1,快速诊断卡的使用,NS1,快速诊断卡的使用,IgM,捕捉,ELISA,法（,MacELISA,）检测登革热,IgM,抗体,检测步骤,1,、,用稀释液按效价稀释抗人,链单克隆抗体，,100l/,孔，加盖，,4,过夜；,2,、弃去抗人,链，用洗涤液重复洗,3,次，甩干，加封闭液，,100l/,孔，置,37,水浴孵育,2,小时；,3,、弃封闭液，用洗涤液重复洗,3,次，甩干。,4,、将待检血清用稀释液从,1,：,10,开始作,2,或,4,倍连续稀释，加入酶标板孔中，,100l/,孔，同时加入已,1,：,10,稀释的阳性血清、阴性血清对照各,4,孔，,100l/,孔，置,37,水浴孵育,2,小时；,5,、弃去血清，用洗涤液重复洗,3,次，甩干，分别加,4,个型,DV,抗原及阴性抗原对照，,100l/,孔，,4,过夜；,6,、弃抗原，用洗涤液重复洗,3,次，甩干，加用稀释液稀释至工作浓度的相应的登革热酶标单克隆抗体，正常抗原加,4,个型混合的酶标单克隆抗体，,100l/,孔，,37,水浴,2,小时；,7,、弃去标记物，用洗涤液重复洗,3,次，甩干，于各反应孔内加,A/B,液各一滴，,37,，避光,3,5,分钟；,8,、加终止液于每反应孔，一滴,/,孔。,IgM,捕捉ELISA,法（,MacELISA,）检测登革热,IgM,抗体,结果判断,1,、目测方法：,阳性对照孔呈明显蓝色，阴性对照孔呈无色，对照成立；若待检血清孔呈明显淡蓝色或深蓝色（,TMB,），则标本为登革热,IgM,抗体阳性，反之阴性。,2,、酶联免疫检测仪检测：,于,450nm,（,TMB,）阳性对照孔,OD,值,/,阴性对照孔,OD,值，即,P/N,2.1,，对照成立；若待检血清孔,OD,值与阴性对照孔,OD,比值,2.1,，则标本为登革热,IgM,抗体阳性，反之阴性。（阴性对照孔,OD,值小于,0.05,按,0.05,记，若大于,0.05,按实际数值计算）,酶联免疫法检测登革病毒,IgG抗体,检测步骤,1,、,用包被液按工作浓度稀释抗原，,100l/,孔，,4,过夜；,2,、弃去包被液，用,PBS-T,重复洗涤,3,5,次，甩干；,3,、将待检血清用稀释液从,1,：,100,开始作,2,或,4,倍连续稀释，加入抗原孔，,100l/,孔，同时设阴、阳性对照，,37,水浴,1,小时；,4,、弃去血清，用洗涤液洗涤,5,6,次；,5,、加酶结合物，用稀释液按工作浓度稀释，,100l/,孔，,37,水浴,1,小时；,6,、弃去酶标抗体，用洗涤液洗涤,6,次，甩干；,7,、加显色液：于各反应孔内加,A/B,液各一滴，,37,，避光,3,5,分钟；,8,、加终止液于每反应孔，,100l/,孔。,酶联免疫法检测登革病毒,IgG,抗体,结果判断,于,450nm,（,TMB,）阳性对照孔,OD,值,/,阴性对照孔,OD,值，即,P/N,2.1,，对照成立；若待检血清孔,OD,值与阴性对照孔,OD,比值,2.1,，则标本为登革热,IgG,抗体阳性，反之阴性。（阴性对照孔,OD,值小于,0.05,按,0.05,记，若大于,0.05,按实际数值计算）,意义,阳性结果，表明曾受到,DV,感染；恢复期血清抗体阳转，或抗体滴度比急性期抗体滴度有,4,倍及以上升高则可确诊。,免疫荧光法检测登革病毒,IgG,抗体,检验步骤：,1,、用,pH7.4,，,0.02mol/L PBS,稀释待检血清，从1:20,开始做,2,倍连续稀释至需要的稀释度。,2,、取出抗原片，用蒸馏水漂洗后，风干。,3,、用加样器依次从高稀释度到低稀释度逐个加入已稀释的待检血清，加入量以覆盖细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢复期血清），在,37,水浴箱湿盒孵育,30,分钟（每次试验同时设阳、阴性对照）。,4,、用,PBS,震荡洗涤,3,次，每次,5,分钟，再用蒸馏水洗涤,1,次脱盐，风干。,5,、用含,1,：,3,万的伊文思兰,PBS,按工作浓度稀释荧光结合物，滴加各孔（以覆盖细胞抗原面为准），在,37,水浴箱湿盒孵育,30,分钟，然后同（,4,）洗涤、漂洗、吹干。,6,、荧光显微镜观察结果。,免疫荧光法检测登革病毒,IgG,抗体,结果判断：,细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，可将免疫荧光反应大致区分为,1,4,个“,+,”。可参考阳性细胞数：,75%,为“,+,”；无特异性荧光者为“,”,（阴性）。检测抗体滴度时，以能观察到明显特异性荧光反应（,“,+,”）最高血清稀释度的倒数表示。,意义：,阳性结果，表明曾受到登革病毒感染，恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有,4,倍或,4,倍以上升高则可确诊。,IgG/IgM,快卡的使用,实验步骤,将快速检测条和试验样本平衡至室温确保无物理损坏。,打开包装，并尽快使用。,在检测卡上标记病人的样本号,取,5l,样品加入微孔,S1,处（靠前），在微孔,S,处（靠后）加入,2,滴缓冲液。,20,分钟判读结果，强阳性标本时间会缩短。,谢 谢,