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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,上海斯丹赛生物技术有限公司,SIDANSAI Biotechnology,Innovator on TALEN technology and Stem Cell research,TALEN,技术在基因功能研究及,ips,领域中的应用,靶向基因修饰,What?,通过某种方法将一个特定靶基因破坏或失活，使其失去原有的功能,Why?,基因敲除是寻找、证明基因功能过程中的必要步骤之一，是基因工程和基因治疗的重要手段。,Way?,如何基因敲除（,Knockout,）,基因敲除的方法,同源重组,(Homologous Recombination),依赖,DNA,分子的互补性，经典基因敲除方法,特点：效率低,（,1 per 10,6,cells,），实验周期长,RNA,干扰,(RNA interference),依赖,RNA,分子,的互补性：高效性，特异性；,特点：临时性，基因沉默而非敲除；,锌指核糖核酸酶（,ZFN,）,20,世纪末,DNA,识别域,(ZFP),+,非特异性核酸内切酶构成（,FokI),依赖,DNA识别域的,特异性：效率高,有脱靶现象，专利被垄断,基因敲除的方法,TALE domain:DNA,识别域,TALE,，,植物病原体,黄单胞菌,Xantomonas,用于调控宿主基因,由,34,的氨基酸长度的重复单位构成,第,12,，,13,位点氨基酸（,repeat-variable di-residue,，,RVD,）不同,RVD,决定识别位点不同,Nuclease domain:DNA,剪切域,FokI,，发现于,海床黄杆菌,Flavobacterium okeanokoites,采取其非特异性,DNA,剪切结构域,形成二聚体时发生剪切,N,C,TALE,FokI,LTPDAVVAIASNI,GGKQALETVQRLLPVLCQDHG,NI,A,HD,C,NG,T,NN,G,A,T,T,C,T,G,C,T,A A,C,T,C,A,T,A,C,新的里程碑技术,：,TALEN,(transcription activator-like effector nuclease,，,2010,年底,),TALEN,切割双链,5,5,3,3,左臂,右臂,FokI,聚合,DSB,Double strand Break,Non-homologous End Joining(NHEJ),Homologous Recombination(HR),无模板,有模板,Gene Disruption,Gene insertion,Gene replacement,TALEN,的组装,(Golden Gate),PCR 3,步,Digest 2,步,Ligate 2,步,一步法连接,只要,4-5,小时，这些片段就全部连接起来了,一步连接,1,2,3,6,5,4,9,13,7,10,12,16,8,14,11,15,17,18,FastTALE,TM,连接,TALEN,N,C,N,C,TALEN modules at 9 positions,TALEN backbone vectors,TALEN assembled vectors,Promoter,FokI,Promoter,FokI,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x16,x16,x4,x16,Position 1,Position 2,Position 3,Position 4,Position 5,Position 6,Position 7,Position 8,Position 9,1/2,9 x 12 dimers,7 x 4 monomers,Complete library:172,CMV,EF1a,Ubi,35S,T7,SP6,Maximum RVDs:19,Minimum RVDs:12,多种,TALEN,骨架载体，满足不同物种需求,第一组载体：,干细胞,专用打靶载体，采用,EF1,启动子。,第二组载体：构建,动物模型,专用载体，含有原核表达启动子,sp6,或,T7,，便于体外转录。,第三组载体：,普通细胞,打靶载体，采用,CMV,启动子。,第四组载体：,植物,专用打靶载体，采用,ubiqutin,或,35s,启动子。,TALEN,质粒构建流程,靶点设计,挑克隆,细菌培养,DNA,质粒抽提,酶切鉴定,得到测序,正确质粒,TALEN,连接,细菌转化,质粒测序,Day 1,Day 2,Day 3,Day 4,4,天,得到构建正确的,TALEN,质粒！,简单、快速！,靶点设计,Decide TALEN target(left arm/right arm),TALE-NT2.0,https:/tale-nt.cac.cornell.edu/,DNASTAR,12-19bp,Spacer:12-21bp,5,end 0 position:must be T,为了得到高活性质粒，建议设计,2X3,组合。,Spacer 12-21bp,5,5,3,3,TALEN,连接,1.,设计序列，,选择模块,2.,加样，,进行连接,4-5h,完成,转化至感受态细胞,在,Kana,+,LB,平板中培养,细菌转化,挑单克隆，细菌培养,挑,5-12,个克隆,（连接效率,50%,）,Kana,+,LB,培养液,单克隆菌落,将单菌落接入含5ml Ka,+,的LB培养液的试管中,DNA,质粒抽提，酶切鉴定,DNA,质粒小抽提,使用,BamHI+PstI,双酶切，植物载体采用,BamHI+SpeI,target:15 nt,target:18 nt,左臂,右臂,1kb Marker,1 kb Marker,Digestion,Digestion,Asssembly length:,15x102=,1530,Asssembly length:,18x102=,1836,On backbone:,531,Total length:,1530+531=,2061,On backbone:,531,Total length:,1836+531=,2367,1,个单模块（由,34,个氨基酸,102,个碱基组成）识别一个碱基,上游引物,:,5-CTCCCCTTCAGCTGGACAC-3,下游引物,:,5-AGCTGGGCCACGATTGAC-3,质粒测序,测序结果比对,标准序列,测序结果,得到测序正确质粒,TALEN,的实际应用,DNA,水平的,基因敲除,DNA,水平的,定点插入,DNA,水平的,单碱基修饰,（点突变）,建立基因敲除,/,敲入的真核细胞系,建立基因敲除,/,敲入的真核生物模型,DNA,水平的,miRNA,敲除,应用实例,1,细胞模型,Hela细胞中,XX,基因敲除的稳转系建立：,项目执行时长,2,个月,设计,TALEN,识别序列；,构建,TALEN,载体；,测序验证,质粒正确性,实验流程：,序列,100%,正确,脂质体转染入,Hela,细胞中；,puromycin,药物筛选,3,天,收集筛选后剩余的部分细胞，抽提基因组,DNA,进行PCR,PCR,产物送测序,比对测序结果，初步确认,TALEN,活性,续上,大于,53%,（每,100,个细胞中有,53,个细胞发生碱基突变）,PCR,产物,TA,克隆、单克隆测序确定打靶效率,续上,2026/2/10 周二,最终挑选出阳性单细胞克隆，扩增，保存，稳定遗传系建立成功,消化细胞呈单细胞，接种于,96,孔板中，待单细胞克隆长大后，同上进行鉴定,部分单细胞克隆测序结果：,单克隆鉴定结果表明：基因改变类型包括插入和缺失两种形式，造成基因移码突变，成功构建稳转系。,挑选至少,50,个单克隆测序,，鉴定出双拷贝敲除的单克隆,续上,Knock-in,载体构建,构建,knock-in,同源重组载体,WT,Donor,提高同源重组效率,同源臂构建简单，,500-1000bp,利用抗性基因快速进行筛选,打靶示意图（基因敲入）,Dirk Hockemeyer,Haoyi Wang,Samira Kiani.Genetic engineering of human ES and iPS cells using TALE nucleases,Nat Biotechnol.;29(8):731734.,打靶示意图（定点突变）,Su Mi Choi,Yonghak Kim,efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells .,HEP,12-2140.,打靶示意图（定点缺失）,打靶效率经验参考,建立,knock-out,细胞系（双拷贝敲除）：,293T,，,hela,细胞：建系,成功率,100%,，目前成功建系,19,个,，打靶效率约为,30%-70%,，最短耗时,2,个月,ES/iPS,细胞：,建系成功率,100%,，目前成功建系,7,个,，打靶效率约为,20%-50%,，最短耗时,4,个月,数据统计至,2013.07,月,打靶效率经验参考,建立,knock-in,细胞系（单拷贝敲入）：,293T,、,hela,细胞等：建系,成功率,100%,，目前已成功建系,6,个,，打靶效率约为,20%-55%,，最短耗时,3,个月,ES/iPS,细胞：建系,成功率,100%,，目前已成功建系,2,个,，最短耗时,5.5,个月,，打靶效率约为,10%-28%,数据统计至,2013.07,月,成功实例,2,动物模型,斑马鱼,Zebra fish-gene A,WT,TALEN,580bp,Zebrafish-geneA(Kpn I),WT,TALEN,580bp,401bp,179bp,Genomic PCR,Restrictive enzyme digest,斑马鱼内,XX,基因敲除,结果回馈,我方设计,TALEN,识别序列；,提供最终的,TALEN,质粒,TALEN,质粒线性化；,体外转录,显微注射一细胞期受精卵,48h,后收集，抽提胚胎,基因组,DNA,PCR,扩增，酶切看结果,打靶效率为,80%,以上,应用实例,3,动物模型,小鼠,1.,设计构建,TALEN,打靶载,2.,细胞水平,TALEN,活性检测,3.,体外转录生成,mRNA,4.,往受精卵,注射mRNA,5.,得到嵌合体小鼠（,F0,）,6.,得到,F1 heterozygote,7.,得到,F2 homozygote,1.,设计构建,TALEN,及,KI donor,载体,2.,细胞水平,TALEN,活性检测,基因,敲除,小鼠,基因,敲入,小鼠,3.,体外转录生成mRNA,4.,往受精卵,注射mRNA,/DNA,混合物,3.,建立,ES,基因敲入细胞系,4.,将,ES,细胞系注射至囊胚,5.,得到,嵌合体小鼠（F0）,6.,得到,F1 heterozygote,7.,得到,F2 homozygote,应用实例,3,动物模型,小鼠,PNAS.2013 M,ar,;110(10):3782-7,应用,I:,基因敲除,TALEN,的实际应用,Nat Biotechnol 2013 Jan;31(1):23-4,Phenotypic analysis of gene-specific knockout mice has transformed our understanding of in vivo gene functions.,Generation of knockout mice,however,remains a time-consuming and expensive process.,Transcription,activator-like(TAL)effector nucleases,(TALENs)are highly effective in inducing mutations at specific genomic,loci,and consequently,TALEN-mediated mutagenesis in zygotesis,a potential alternative to conventional gene,targeting in mice.,设计构建,TALEN,打靶载体,细胞水平,TALEN,活性检测,体外转录生成,mRNA,往受精卵,注射mRNA,嵌合体小鼠（,F0,）,F1 heterozygote,F2 homozygote,应用,II,：基因敲入,TALEN,的实际应用,The functional study of,Y chromosome genes,has been hindered by a lack of mouse models with specific Y chromosome mutations.We used transcription activator-like effector nuclease(TALEN)-mediated gene editing in mouse embryonic stem cells(mESCs)to produce mice with targeted,gene disruptions and insertions,in two,Y-linked genesSry and Uty,.TALEN-mediated gene editing is a useful tool for dissecting the biology of the Y chromosome.,Nat Biotechnol 2013 Jan;31(6):530,-32,利用,TALEN,技术建立,ES,敲除,/,敲入细胞系,建立动物模型,四倍体细胞,补偿法,验证基因表达水平,应用,III:,基因定点修复,TALEN,的实际应用,应用,:DNA,水平的,miRNA,敲除,TALEN,的实际应用,思路,1,：,针对,miRNA,的关键识别序列,”seed”sequence,特异性设计一对,TALEN,，实现,miRNA,的敲除。,思路,2,:,在,miRNA,前体,发夹结构,的,上下游处,分别设计一对,TALEN,，利用,TALEN,将,包含,发夹结构,在内,的,DNA,片段剪切致缺失，从而实现对,miRNA,的敲除。,PlOS one 8(9),2013(5),TALEN,广泛应用,Biotechnol Bioeng.2013 Mar 18.doi:10.1002/bit.24890,拟南芥,短兵草,牛,蟋蟀,果蝇,仓鼠,人,青鳉,小鼠,线虫,大鼠,水稻,蚕,烟草,酵母,斑马鱼,斯丹赛部分成功案例,北京大学,张老师成功建立,人,ES,细胞某基因敲除系,北京大学,尹老师成功在人结肠癌细胞系以及,Hela,细胞系中打靶成功，打靶效率约为,30%,长征医院,周老师成功建立,乳腺癌细胞,某基因敲入细胞系,清华大学,罗老师成功建立,小鼠,ES,细胞某基因,敲入系,中国科学院生物物理研究所,范老师成功建立,小鼠,MEF,细胞,某基因敲除系,上海生化所,宋老师利用培训班拿到的平板直接建立,仓鼠细胞,某基因敲除系；,细胞建系成功案例,斯丹赛部分成功案例,华东师范大学,王老师课题组针对,5,个靶基因分别构建了,2X3,组合的,TALEN,质粒，目前已成功得到其中,1,个基因敲除的小鼠模型（打靶效率,30%,：,10,只,F0,代小鼠中有,3,只突变体）；同时另,4,个基因已得到经细胞水平验证后的高活性,TALEN,质粒，并正在后续建模中。,南京大学,官老师成功得到某基因敲除小鼠模型，打靶效率,12.7%,南方模式,费老师成功得到,6,个基因敲除小鼠模型,华东师范大学,李老师成功得到某基因敲除小鼠模型,.,小鼠建模成功案例,斯丹赛部分成功案例,中国科学院水生生物研究所,肖老师成功得到斑马鱼,F1,代杂合子，效率为,14/16,，并且后续得到,F2,代纯合子,复旦大学 姚老师成功得到斑马鱼某基因敲除的,F1,代杂合体,健康所 荆老师成功的得到了斑马鱼突变体，打靶效率达,20%,；,华中科技大学,刘老师成功得到斑马鱼某基因敲除的突变体；,斑马鱼建模成功案例,斯丹赛部分成功案例,中国科学院生物物理研究所,龚老师成功检测到某基因敲入的,F0,代果蝇突变体；,北京生命科学研究所,王老师成功获得,F0,突变体果蝇；,珠海威康健生物科技有限公司,杨老师成功获得,F0,突变体果蝇；,湖南师范大学,邓老师成功获得,F0,突变体果蝇,果蝇建模成功案例,专业、完善的技术保障,保证客户得到一对高活性,TALEN,质粒并且最终建系,/,建模成功；,拥有强大的技术团体，提供全程免费的技术支持；,协助客户完善,TALEN,平台的构建；,若发生建系,/,建模失败，则全额退款。,TALEN,在,iPS,领域的应用,用于,iPS,建立的体细胞来源,皮肤成纤维细胞,骨髓来源的细胞,脂肪干细胞,肠上皮细胞,尿液细胞,-,无创！,毛囊间充质干细胞,胸腺来源的细胞,血液细胞,。,一,切,体,细,胞,皆,有,可,能,！,Oct4,Sox2,Klf4,C-myc,TALEN,技术,iPS,细胞,基因敲除,iPS,细胞,定点修复,iPS,细胞,定向分化,体外研究：疾病模型建立,;,发病过程研究,;,疾病机理研究,;,药物筛选,体内应用,再生医学,疾病模型,用于疾病机理研究,ips,细胞系,基因敲除的,ips,细胞系,不同组织,研究基因功能及和疾病的影响,TALEN,技术,定向分化,病人样本,APOB:,缺失降低,HCV,病毒的复制效率,SORT1降低肝细胞,ApoB,分泌；,影响脂肪细胞中葡萄糖转运；,介导运动神经元的死亡,AKT2,：调节肝细胞及脂肪细胞中的,胰岛素通路和糖代谢过程,PLIN1,：影响脂肪细胞中脂质分解过程,We report here the use of TALENs to rapidly and efciently,generate mutant alleles of 15 genes in cultured somatic cells or human pluripotent stem cells,the latter for which we differentiated both the targeted lines and isogenic control lines,into various metabolic cell types,.We demonstrate cell-autonomous phenotypes directly linked to diseasedyslipidemia,insulin resistance,hypoglycemia,lipodystrophy,motor-neuron death,and hepatitis C infection,.We found,little evidence of TALEN off-target effects,but each clonal line nevertheless harbors a signicant number of unique mutations.Given the speed and ease with which we were able to derive and characterize these cell lines,we anticipate,TALEN-mediated genome editing of human cells becoming a mainstay for the investigation of human biology and diseaseiPS,细胞系定点修复,利用,TALEN,、,ZFN,技术,成功实现对,ips,细胞的定点修复,！,定点修复后的,ips,细胞系经,定向分化得到正常细胞,！,iPS,细胞系定点修复,iPS,细胞系定点修复,修复后的,ips,细胞系定向分化得到的正常细胞可,提高疾病小鼠的生存率,！,TALEN,的实际应用,DNA,水平的基因敲除,DNA,水平的定点插入,DNA,水平的单碱基修饰（点突变）,DNA,水平的,miRNA,敲除,以上的各种组合。,技术革新推动科研进步,上海斯丹赛生物技术有限公司,order,市场部：,021-58959719,market,技术支持：,021-38723968,service,做科研很难,做,TALEN,不难,TALEN,尽在斯丹赛,谢谢！,