琼脂糖凝胶电泳-初学版.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,分子生物学实验技术专题,分子生物学实验技术专题,凝胶电泳技术,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子杂交技术,Southern blot,Northern blot,质粒提取、细菌总,DNA,提取,电泳技术简介,什么是电泳技术？,电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在,惰性支持介质,（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。,电泳技术的分类,电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。,自由电泳包括,Tise-leas,式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。,区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、醋酸纤维薄膜电泳、非凝胶性支持体区带电泳（支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等,),、,凝胶支持体区带电泳,（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。,凝胶电泳技术,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳：实验原理,琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是,D-,半乳糖和,3.6-,脱水,-L-,半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。其本身不带有电荷。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。,琼脂糖凝胶电泳：实验原理,DNA,分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。,DNA,分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同,DNA,的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。,DNA,分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的,DNA,，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的,DNA,分子。,琼脂糖与琼脂的区别,琼脂是由琼脂糖（,agarose,）和琼脂果胶（,agaropectin,组成的。琼脂糖的结构单元是,D-,半乳糖和,3.6-,脱水,-L-,半乳糖；琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物。它们的结构相似，但琼脂果胶带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。,在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除，否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基团，就会造成电内渗，电内渗对质点的移动产生影响。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比较低，通常在,0.2%,以下，电内渗比较小，通常在,0.13%,以下。,简言之，,琼脂糖是从琼脂中精细提取的,，有自身独特的性质，所以琼脂糖要比琼脂贵得多。,琼脂糖凝胶电泳特点,优 点,因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗,对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。,凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。,透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。,不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定,有热可逆性,缺 点,机械强度差，易破碎，浓度不能太低。,易被细菌污染，不易保存，临用前配制。,琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。,与,PAGE,相比，分子筛作用小，区带少。,琼脂糖凝胶的配置,1.,根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶缓冲液。一般为,1 TAE,或,0.5TBE,。,注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的。,2.,根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉。,注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的,50%,容量。,3.,在微波炉中加热溶解琼脂糖,注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。微波炉中加热时间不宜过长。,琼脂糖凝胶的配置,3.,使溶液冷却至,60,左右，如需要可在此时加入溴化乙锭,(EB),溶液使其终浓度为,0.5ug/ml,，并充分混匀,不提倡使用。,注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的溶液时，请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解。,5.,将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在,3,5 mm,之间。,注意：不要产生气泡，溶液温度太高,(60,),，会使得水分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。,6.,在室温下使胶凝固（大约,30,分钟），然后放置于电泳槽中进行电泳。,注意：凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在,4,下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存,2,5,天。,琼脂糖凝胶缓冲液,有几种缓冲液适用于天然双链,DNA,的电泳,Tris-,乙酸盐和,EDTA,缓冲液（,pH8.0,TAE,，也称为,E,缓冲液）,Tris-,硼酸盐缓冲液,(TBE),Tris-,磷酸盐缓冲液,(TPE),琼脂糖凝胶缓冲液,琼脂糖凝胶缓冲液,琼脂糖凝胶缓冲液,TBE,可以使用,10,次左右，而,TAE,用,23,次就要更换。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，,pH,值上升，缓冲性能下降，可能使,DNA,条带模糊或不规则,DNA,带迁移。,电泳缓冲液刚好没过凝胶,1mm,为好，太多则电流加大，凝胶发热。,琼脂糖凝胶载样缓冲液,载样缓冲液是上样时与样品一起加入泳道的。载样缓冲液有三个作用：,增加样品密度以保证,DNA,沉入加样孔内；,使样品带有颜色便于上样操作；,其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。,上样缓冲液有几种，但基本都包括溴酚蓝和二甲苯氰,FF,。,琼脂糖凝胶载样缓冲液,溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰,FF,的,2.2,倍，这一特性与琼脂糖凝胶的浓度无关；,在,0.5TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速率约与长约,300bp,的线性双链,DNA,相同，而二甲苯氰,FF,约与长,4kb,的,DNA,相同。在,0.5%-1.4%,浓度的琼脂糖凝胶中基本不会变化。,琼脂糖凝胶载样缓冲液,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,DNA,分子大小迁移速率,U,与,logN,成反比（,N,为碱基对数目）。分子越大，摩擦阻力越大，同时大分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子，所以分子大的迁移慢。,等量的空间结构，紧密的电泳快（超螺旋,线性,DNA,）,一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,简言之，浓度越大，分子孔径就越小，,DNA,迁移速率就越低，反之迁移速率就大。,另外，浓度也跟凝胶的分辨率有关，浓度越大，分辨率越高，但分离的片段就越小。,琼脂糖凝胶的浓度,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,一般迁移速率超螺旋环状,线状,DNA,单链开环。,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,低电压时，线状,DNA,片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过,5-8V/cm,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,包括标准琼脂糖和低熔点琼脂糖以及正在研制的介于二者之间的琼脂糖。其分辨率等各有不同。,琼脂糖凝胶的浓度,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,溶液,pH,值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液,pH,还会影响到其电泳方向,;,溶液的离子强度过低，会使电导率降低，,DNA,不是全然不动就是迁移极慢；而离子过强时，电导率上升，会产生大量热能，使凝胶变化甚至熔化，也会使,DNA,变性。,影响电泳迁移率的因素,DNA,分子的大小,1,凝胶的浓度,2,DNA,的构象,3,使用的电压,4,琼脂糖的种类,5,电泳缓冲液,6,嵌入染料的存在,7,染色剂溴化乙锭插入双链,DNA,造成其负电荷减少、刚性和长度增加，因此，线性,DNA-,染料复合物在凝胶中的迁移率约降低,15%,。,DNA,电泳常见问题分析,问题,原因,解决办法,DNA,带模糊,1)DNA,降解,避免核酸酶污染,2),电泳缓冲液陈旧,电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，,pH,值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液,3),所用电泳条件不合适,电泳时电压不应超过,20V/cm,，温度,30,；巨大,DNA,链电泳，温度应,15,；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力,4)DNA,上样量过多,减少凝胶中,DNA,上样量,5)DNA,样含盐过高,电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐,6),有蛋白污染,电泳前酚抽提去除蛋白,7)DNA,变性,电泳前勿加热，用,20mM NaCl,缓冲液稀释,DNA,DNA,电泳常见问题分析,问题,原因,解决办法,不规则,DNA,带迁移,1),对于,/,Hin,d III,片段,cos,位点复性,电泳前于,65,加热,DNA 5,分钟，然后在冰上冷却,5,分钟,2),电泳条件不合适,电泳电压不超过,20V/cm,；温度,30,；经常更换电泳缓冲液,3)DNA,变性,以,20mM NaCl Buffer,稀释,DNA,，电泳前勿加热,带弱或无,DNA,带,1)DNA,的上样量不够,增加,DNA,的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低,2)DNA,降解,避免,DNA,的核酸酶污染,3)DNA,走出凝胶,缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度,4),对于,EB,染色的,DNA,，所用光源不合适,应用短波长（,254nm,）的紫外光源,DNA,电泳常见问题分析,问题,原因,解决办法,DNA,带缺失,1),小,DNA,带走出凝胶,缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度,2),分子大小相近的,DNA,带不易分辨,增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度,3)DNA,变性,电泳前请勿高温加热,DNA,链，以,20mM NaCl Buffer,稀释,DNA,4)DNA,链巨大，常规凝胶电泳不合适,在,脉冲凝胶电泳上分析,