双向电泳技术和实验流程.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,双向电泳技术和实验流程,1,第一页，共45页。,一、电泳的基本原理,1,、在电场作用下，带电颗粒向着与其电性相反的方向移动的现象称为电泳（,electrophoresis),。,由,F=Eq,，,f=6,r,可得,=,Eq/(,6,r,),2,、带电颗粒的泳动速度同,电场强度,和分子本身所带的,净电荷量,成,正比,，与,颗粒半径,和,介质黏度,成,反比,。,蛋白质是一种两性电解质。其泳动速度取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量以及颗粒的大小和形状。,第一节 蛋白质电泳的基本原理,2,第二页，共45页。,在一定,pH,条件下，每一种分子都具有特定的电荷,(,种类和数量,),、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。,3,第三页，共45页。,二、影响电泳速度的因素,1,、电场强度；,2,、缓冲溶液的,pH,；,3,、缓冲溶液的离子强度4,、电渗；,5,、焦耳热,三、电泳的分类,按原理分类：,自由界面电泳,：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。,稳态电泳,（或称置换电泳）：分子颗粒的电泳迁移在一定时间达到一个稳态后，带的宽度不随时间而变化。,区带电泳,：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。,4,第四页，共45页。,5,第五页，共45页。,按,支持介质种类,的不同，区带电泳可分为,纸电泳,：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。,醋酸纤维素薄膜电泳,：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。,以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。,6,第六页，共45页。,淀粉凝胶电泳,：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。,琼脂糖凝胶电泳,：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。,聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。,7,第七页，共45页。,另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、板电泳、柱电泳。,根据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量电泳、免疫电泳。,按,pH,的连续性不同，可分为：连续,pH,电泳，不连续,pH,电泳。,8,第八页，共45页。,四、聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,（,polyacrylamidegel electrophoresis,，简称,PAGE,）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。,PAGE,应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等。,9,第九页，共45页。,第四十四页，共45页。,其中R代表羧基或第三氨基。,化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。,蛋白质分子按照自己的pI位置在固相pH梯度中迁移，知道达到自己的等电点，停止迁移。,化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。,这种方法形成的pH梯度很不稳定，重复性差，现已不使用。,加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白的二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成蛋白-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于蛋白分子量。,组成每一种蛋白质或多肽的氨基酸的数目和比例是不同的，故蛋白质的等电点范围很宽，这使得可以利用它来分离和分析蛋白质。,根据建立pH梯度原理不同，可分为载体两性电解质pH梯度（carrier ampholyte pH gradient)和固相pH梯度(immobilized pH gradient,IPG)。,5、得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术,利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的（或非线性）pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。,第二十三页，共45页。,001pH，是目前分辨率最高的电泳方法之一。,化学组成不同于被分离物质，不干扰测定。,3、缓冲溶液的离子强度；,1,、丙烯酰胺凝胶有以下优点：,几乎无电渗作用。,化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。对,pH,和温度变化较稳定。,在一定浓度范围内凝胶无色透明，有弹性，机械性能好，易观察。,凝胶孔径可调。,分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。,10,第十页，共45页。,2,、聚丙烯酰胺凝胶的聚合,11,第十一页，共45页。,催化剂和加速剂的种类,AP-TEMED,：化学聚合作用。,加速剂四甲基乙二胺,(TEMED),的碱基可使催化剂过硫酸铵,(,简称,AP),的水溶液产生出游离氧原子，然后激活,Acr,单体，形成单体长链，在交联剂,Bis,作用下聚合成网状的凝胶。,核黄素,-TEMED,：光聚合作用。,光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能发生，因为核黄素在,TEMED,及光照条件下，还原成无色核黄素，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。,12,第十二页，共45页。,13,第十三页，共45页。,丙烯酰胺会产生如下几个化学反应：,高浓度酸和碱会促进其水解形成丙烯酸和,NH3,。,与一些羟基化合物如酚或酯族醇反应，生成,-,芳氧基或烷氧基丙酰胺。,在,20,能,NH3,反应，生成,、,、,-,氮川三丙酰胺。,与一些硫醇反应，生成,-,烷基丙酰胺。,也会由于超声、,-,射线和自然光线引起聚合作用。如果烃键靠近在高度聚合的位置，酰胺基也会受到分子间的缩聚作用而成亚胺桥。,14,第十四页，共45页。,凝胶的孔径可调性及其他性质,每,100,亳升凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度，用,T%,表示；,T%=(a+b)/m,a,：丙烯酰胺克数；,b,：,N,N-,甲叉双丙烯酰胺克数；,m,：缓冲液体积,(,毫升,),。,3,、聚丙烯酰胺凝胶的,有效孔径,：,15,第十五页，共45页。,16,第十六页，共45页。,浓缩效应,17,第十七页，共45页。,聚丙烯酰胺凝胶电泳的异常现象及解决办法,1.,凝胶未聚合,2.,未加水层时凝胶聚合,3.,电泳后未能检测出样品,4.,样品分离区带宽或拖尾,5.,只显一条区带,6.,分离区带呈条纹状,18,第十八页共45页。,第二节 蛋白质等电聚焦电泳,1966,年，瑞典科学家,Rible,和,Vesterberg,建立。,等电聚焦：,isoelectric focusing,IEF,。,1.,电泳系统中加进两性电解质载体，当通直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的,pH,梯度。蛋白进入时，不同的蛋白移动到与其等电点相当的,pH,位置上，从而使不同等电点的蛋白得以分离。,2.,优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定蛋白或多肽的等电点。,3.,缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白。,19,第十九页，共45页。,利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，在一个,稳定的、连续的、线性的（或非线性）,pH,梯度,中进行蛋白质的分离和分析。分析对象只限于蛋白质和其他两性分子。,根据建立,pH,梯度原理不同，可分为,载体两性电解质,pH,梯度（,carrier ampholyte pH gradient),和,固相,pH,梯度,(immobilized pH gradient,IPG),。,20,第二十页，共45页。,一、基本原理,1,、蛋白质的等电点：取决于其氨基酸的组成。,组成每一种蛋白质或多肽的氨基酸的数目和比例是不同的，故蛋白质的等电点范围很宽，这使得可以利用它来分离和分析蛋白质。,21,第二十一页，共45页。,2,、聚焦效应,3,、等电聚焦的分辨率,22,第二十二页，共45页。,二、载体两性电解质,pH,梯度等电聚焦电泳,1,、载体两性电解质应具备的条件,在等电点处有足够的缓冲能力，以便能控制,pH,梯度，而不致被样品的缓冲能力而改变,pH,梯度。,在等电点处有足够高的电导，以便使一定的电流通过，具备不同,pH,的载体有相同的电导系数，是整个体系中的电导均匀。,分子质量小，便于与被分离的高分子物质分离。,化学组成不同于被分离物质，不干扰测定。,应不与分离物质反应或使之变性。,由多乙烯多胺与丙烯酸加成制备,(,有不同,pH,范围的商品两性电解质载体,),23,第二十三页，共45页。,2,、载体两性电解质,pH,梯度的形成,有两种方法产生,pH,梯度：,用两种不同的,pH,的缓冲液互相扩散，在混合区形成,pH,梯度。这种方法形成的,pH,梯度很不稳定，重复性差，现已不使用。人工,pH,梯度。,利用载体两性电解质在电场作用下自然形成,pH,梯度，常用该方法。天然,pH,梯度。,24,第二十四页，共45页。,3,、载体两性电解质分离原理,等电聚焦样品可放于任何位置。,4,、载体两性电解质的缺点,载体两性电解质合成过程复杂，影响蛋白质点的位置，从而影响了重复性；,负极漂移现象，使,pH,梯度不稳定；,负极漂移现象使碱性蛋白质无法聚焦；,凝胶灌制重复性差，凝胶机械稳定性差，影响重复性。,5,、等电聚焦中应注意的事项,pH梯度的选择；,添加中性载体两性电解质；,电流降到最小切恒定时尽快结束,IEF;,pH,梯度测定：电泳结束后，用微电机检测凝胶表面,pH;,蛋白质在,pI,处形成沉淀。添加表面活性剂。,25,第二十五页，共45页。,三、固相,pH,梯度等电聚焦电泳技术,固相,pH,梯度等电聚焦是,80,年代建立起来的一种等电聚焦技术。固相,pH,梯度等电聚焦比传统等电聚焦具有更高的分辨率，更大的上样量，其分辨率可达到,0.001pH,，是目前分辨率最高的电泳方法之一。,26,第二十六页，共45页。,1,、固相,pH,梯度的介质,其所用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物，它们与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有相似的聚合行为。,27,第二十七页，共45页。,2,、固相,pH,梯度的建立,固相,pH,梯度等电聚焦技术的突破要归功于,Immobilines,试剂（,Amersham Pharmacia Biotech,APB,）的基础上开发的固相,pH,梯度（,IPG,）技术。,Immobilines,（固相试剂）是一系列性质稳定的具有弱酸弱碱性质的丙烯酰胺衍生物，与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有类的聚合行为。每个分子都有一个单一的酸性或碱性缓冲基团与丙烯酰胺单连，其结构式为：,其中,R,代表羧基或第三氨基。分子一端的双键可以在聚合过程中共价键合镶嵌到聚丙烯酰胺介质中。所以它是固相的，即使是在电场中也不会漂移。分子另一端的,R,基团为弱酸或弱碱性的缓冲基团，利用缓冲体系滴定终点附近一段,pH,范围就可形成近似线性的分布在,pH3,10,范围的缓冲体系。,所以固相,pH,梯度与载体两性电解质,pH,梯度的区别在于前者的分子不是两性分子，在凝胶聚合时候便形成,pH,梯度，不随环境电场条件的改变而改变，后者是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后才形成,pH,梯度。,28,第二十八页，共45页。,固相,pH,梯度聚丙烯酰胺凝胶基质结合缓冲基团,29,第二十九页，共45页。,4,、固相,pH,梯度的优点和注意事项,3,、固相,pH,梯度等电聚焦原理,蛋白质分子按照自己的,pI,位置在固相,pH,梯度中迁移，知道达到自己的等电点，停止迁移。,固相,pH,梯度可窄至,pH0.1,的范围，因此分辨率极高，可达,0.001pH,；,pH,梯度稳定，不漂移；灵活性大，可随意选择,pH,梯度和斜率；重复性好；加样容量大；样品中盐的干扰小；对碱性蛋白质也能很好的分离，无边缘效应，故可用很窄的胶条（如,5mm,宽）聚焦，特别适合于双向电泳的第一相，但固相,pH,梯度灌胶技术复杂，只能使用聚丙烯酰胺凝胶，电泳时候需要高电压，电泳时间长，窄范围,pH,测定困难，只能计算。,注意事项,：温度：,20-30,；,电压：梯度上升。,30,第三十页，共45页。,加样方式,31,第三十一页，共45页。,等电聚焦电泳进行过程中,等电聚焦电泳结束后,（）,（）,高,pH,高,pH,低,pH,低,pH,32,第三十二页，共45页。,第三节,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,一、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳,1,、基本原理,:,天然状态生物大分子聚丙烯酰胺凝胶电泳（,native PAGE,）,在恒定的、非解离的缓冲系统中分离蛋白质。可得到天然蛋白质的分子量。,33,第三十三页，共45页。,连续电泳,不连续电泳,浓缩效应,凝胶层,缓冲液离子成分,pH,电位梯度,浓缩效应,电荷效应,分子筛效应,34,第三十四页，共45页。,2,、影响凝胶聚合的因素,形成凝胶试剂的纯度,凝胶浓度,温度和氧气的影响：,23-25,3,、聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点,35,第三十五页，共45页。,二、,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,1,、基本原理,聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠,(sodium dodecylsulphate)SDS,，蛋白电泳迁移率取决于其分子量，而与形状及所带电荷无关。,加入,SDS,和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白的二硫键还原，,SDS,使氢键、疏水键打开，并结合到,P,分子上，形成蛋白,-SDS,，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于蛋白分子量。,分离测定：,测分子量,(,与标准蛋白比较,),鉴定样品纯度,(,条带数目,),测定样品蛋白含量：扫描定量,(,比色,),36,第三十六页，共45页。,2,、,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳的分类,3,、,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳的影响因素,溶液中,SDS,单体的浓度,二硫键是否完全还原,缓冲系统的选择,凝胶浓度的选择,37,第三十七页，共45页。,凝胶电泳的操作要点,1.,凝胶制备,2.,电极缓冲液,3.,样品处理及加样,4.,电泳,5.,染色与固定,6.,脱色,7.,分析,38,第三十八页，共45页。,？,pH,值不对,=,39,第三十九页，共45页。,第四节 双向电泳,一、基本原理,IEF-SDS-PAGE,40,第四十页，共45页。,非变性,2D-PAGE,：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的；,非变性,/SDS-2D-PAGE,：第一向采用非变性,IEF,，之后在,2%SDS,溶液中平衡；第二向也在,SDS,存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白蛋白间的相互作用。,非变性,/,还原,/SDS-2D-PAGE,：非变性条件下,IEF,聚焦，之后用,8M,尿素,5%-ME,2%SDS,进行平衡，再进行第二,向,SDS-PAG,电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、,MALDI-TOF-MS,分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。,变性,2D-PAGE,：样品先用,2%SDS,5%-ME,95,变性,5min,，,IEF,在,8M,尿素,1%NP-40,条件下进行，之后胶条用,2%SDS,5%-ME,平衡，然后进行,SDS-PAGE,。该技术适于,DNA,序列和多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于,100Kd,的蛋白质点少于第三种方式,双向电泳的分类,41,第四十一页，共45页。,二、流程,（一）样品制备,（二）第一向：等电聚焦,1,、加样,2,、运行,（三）胶条的平衡,（四）第二向：,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,（五）胶上蛋白的检测,1,、考马斯亮蓝染色,2,、银染,3,、负染,4,、荧光染色,42,第四十二页，共45页。,（六）双向电泳凝胶的检测,1,、目测,2,、自动化检测,3,、双向电泳的数据库,（七）双向凝胶电泳技术当前面临的挑战：,1,、低拷贝蛋白的检测受限；,2,、极酸或极碱蛋白的分离较难；,3,、分子质量极大或极小蛋白的分离较难；,4,、难溶蛋白的检测较困难；,5,、得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术,43,第四十三页，共45页。,一维固相,pH,梯度等电聚焦（,IEF with IPG,）：,IPG,胶的材料是,Immobilines,，为拥有,CH2=CH-CO-NH-R,结构的,8,种丙烯酰胺衍生物系列，其中,R,包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在,pH310,不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的,IPG,试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成,pH,梯度。通过这种方式生成的,IPG,不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的,IEF,分离达到真正的平衡状态。,44,第四十四页，共45页。,IPG,胶条的重泡胀,泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入,IPG,内，从而能进行接下来的,IEF,。,不同的加样方法和加样量会导致最终结果的差异：,Protean IEF cell,、,IPGphor,等集成设备的使用：,20mmol/L DTT,垫片的使用：,温度的选择：,45,第四十五页，共45页。,