DNA的三级结构.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,噬菌体,T,2,DNA,长约50,m,E-,coli,DNA,长约1,mm,人生殖细胞,DNA,长约1,m,（三）,DNA,的三级结构,双链环状,DNA（double stranded cyclic DNA,DSCDNA）,双链环状,DNA,在自然界是广泛存在的，如一些病毒,DNA、,一些噬菌体,DNA、,细菌质粒,DNA、,线粒体和叶绿体,DNA,等。,1共价闭合环状,DNA（covalently closed circular,DNA,cccDNA,）,的,超螺旋,结构（,superhelical,structure）,形成超螺旋的基础:,DNA,双螺旋的扭曲形成超螺旋（,superhelix,）,负超螺旋,正超螺旋,超螺旋,DNA,的性质,结构紧密，粘度较低，浮力密度大，沉降速度快。,变性,2开环,DNA（open circular DNA,ocDNA,）,也称松环,DNA（relaxed circular DNA,rcDNA,）,+,3连环,DNA（,Catenanes,DNA）,单体,二聚体,1重复序列 （,repeated sequence）,（1）高度重复序列（,highly repeated sequence）,卫星,DNA（satellite DNA）,基因组（,genome）四）真核细胞染色体,DNA,结构,主体,DNA（bulk DNA）,卫星,DNA（satellite DNA）,（2）中度重复序列（,moderately repeated sequence）,（3）单一序列（,unique sequence）,2回文结构（,palindromic,structure）,(1)回文结构,回文结构也称反向重复（,inverted repeats）,(2)发夹形和十字形,（一）,RNA,的类别,1核糖体,RNA（ribosomal RNA,rRNA,）,2转移,RNA（transfer RNA,tRNA,）,3信使,RNA（messenger RNA,mRNA五、,RNA,的结构,4其它类别的,RNA,（1）病毒,RNA（Viral RNA,rRNA,）,（2）核内,RNA（nuclear RNA,nRNA,）,不均一核,RNA（heterogeneous nuclear RNA,HnRNA,）,小分子核,RNA（small nuclear RNA,sn,RNA）,小分子核仁,RNA（small,nucleolar,RNA,sno,RNA）,染色体,RNA（chromosomal RNA,ch,RNA）,（3）线粒体,RNA（,mitochondrial,RNA,mit,RNA）,（4）叶绿体,RNA（chloroplast RNA,chlRNA,或,ctRNA,）,（二）,RNA,的一级结构,1,RNA,分子中核苷酸之间的连接方式,3,5-磷酸二酯键,2,RNA,分子中核苷酸的排列顺序,酵母,tRNA,Ala,小片段重叠法,直接阅读法（直读法）,1965年,3几类,RNA,的一级结构,（1）,tRNA,的一级结构,tRNA,一级结构的共同点:,Mr,较小（,Mr,25000），,沉降常数4,S。,各种,tRNA,的链长很接近，一般在7393个核苷酸之间。,tRNA,分子中约20多个位置上的核苷酸是保守的（不变和半不变的）,各种,tRNA,的3一端为,CCA；5,一端大多数为,pG,，,少数为,pC,。,tRNA,分子中含有较多的修饰成分。,（2）,rRNA,的一级结构,原核生物核糖体,70,S,50,S,30,S,5,S,rRNA,，23S,rRNA,34种蛋白质,16,S,rRNA,21种蛋白质,真核生物核糖体,80,S,60,S,40,S,5,SrRNA,，5.8SrRNA，28SrRNA,49种蛋白质,18,SrRNA,33种蛋白质,（3）,mRNA,的一级结构,真核生物,mRNA,的一级结构可用下式表示:,5-帽子,5-非密码区,密码区,3-非密码区,polyA,5-,cap：m,7,G(5),pppNmp,5-,cap,cap0:m,7,G(5),pppNp,cap1:m,7,G(5),pppNmpNp,cap2:m,7,G(5),pppNmpNmpNp,5-,cap,的功能,(1)防止,mRNA,被核酸酶降解。,(2)为,mRNA,翻译活性所必需。,(3)与蛋白质合成的正确起始有关。,3-,polyA,:,polyA,的残基数20200个，或更多。,polyA,的功能,(1)保护,mRNA,，,免受核酸外切酶的作用。,(2)与翻译有关，没有,polyA,翻译活性降低。,(3)与,mRNA,从细胞核转移到细胞质有关。,RNA,前体,成熟,RNA（,有功能的,RNA）,断裂、修剪、修饰,（三）,RNA,的二级结构,大多数天然,RNA,是一条单链，通过自身回折形成部分螺旋区，部分非螺旋区。,少数病毒RNA,如水稻矮缩病毒、呼肠孤病毒、伤瘤病毒等,RNA,是双链螺旋，类似于,DNA,的双螺旋结构。,RNA,中双螺旋结构稳定的因素主要是碱基堆积力，其次是氢键。,1,tRNA,的二级结构,（1）,aa,接受臂（,amino acid arm）,（2）二氢尿嘧啶环,（,dihydrouridine,loop,DHU loop）,（3）反密码环（,anticodon,loop）,（4）额外环（,extra loop）,（5）,TC,环（,TC loop）,X,光晶体衍射解出的,tRNA,立体结构,1980年牛心线粒体,tRNA,ser,只有63个核苷酸，沉降常数3,S，,缺少,D,环和,D,臂，呈二叶草型。,近年来发现2种线虫线粒体,tRNA,也不是标准的三叶草结构。,2,rRNA,的二级结构,3,mRNA,的二级结构,The secondary structure of HEC-SODs,mRNA,.,the free energy of result is 587.9J.,（四）,RNA,的三级结构,tRNA,的三级结构,六、核酸酶类,包括核酸水解酶、合成酶、连接酶等。,（一）核酸水解酶的分类,1底物：核糖核酸酶（,ribonuclease,RNase,）,脱氧核糖核酸酶（,deoxyribonuclease,DNase,）,2作用方式：核酸内切酶（,endonuclease,）3按磷酸二酯键断裂的方式,4其它：如双链酶、单链酶等,核酸外切酶（,exonuclease,）,（二）核糖核酸酶类,1牛胰核糖核酸酶（,pancreatic,ribonuclease,简称,RNase,A,或,RNase,I）,2核糖核酸酶,T,1,（,ribonuclease,T,1,，,简称,RNase,T,1,）,3核糖核酸酶,T,2,（,ribonuclease,T,2,，,简称,RNase,T,2,）,主要作用点为,Ap,残基，水解速度,AUGC,A,U,C,G,A,G,（三）脱氧核糖核酸酶,1牛胰脱氧核糖核酸酶,（,pancreatic,deoxyribonuclease,简称,DNase,I）,2牛脾脱氧核糖核酸酶,（,spleen,deoxyribonuclease,简称,DNase,II）,3限制性内切酶（,restriction,endonuclease,）,简称限制酶,限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的,DNA，,对自身起了保护作用。,发现概况:,（1）限制性内切酶的特征,具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点,粘性未端，平整末端,（2）限制性内切酶的命名,Eco,RI,（3）限制性内切酶举例,（四）非专一性核酸酶类（,nonspecific nuclease）,介绍二种外切酶,1蛇毒磷酸二酯酶（,venom,phosphodiesterase,5,-核苷酸,蛇毒磷酸二酯酶对末端磷酸基有严格的要求,寡核苷酸,水解速度,最快,较慢，水解速度降低10倍,最慢，几乎不作用，水解速度再降低100倍,橘青霉磷酸二酯酶专一性：,与蛇毒磷酸二酯酶相同,2牛脾磷酸二酯酶,对末端磷酸基的要求与蛇毒磷酸二酯酶相反,+,3-核苷酸,（五）磷酸单酯酶,将单核苷酸或寡核苷酸末端的磷酸单酯键切开，得到磷酸和其它产物,1特异性磷酸单酯酶,2非特异性磷酸单酯酶,磷酸基无论在3或5位，都能水解，如,E.,coli,磷酸单酯酶,（1）磷酸基连在5位才能水解，如牛精液5-核苷酸酶,（2）磷酸基连在3位才能水解，如麦芽3一核苷酸酶,（一）一般性质：分子大小、性状、溶解度分子大小：,DNA,Mr,10,6,10,10,或更大,性状：,DNA,为白色纤维状固体，而,RNA,为白色粉末。,溶解度：,DNA,和,RNA,均不溶于一般的有机溶剂，微溶于水，,但它们的钠盐在水中溶解度较大。,RNA,Mr,10,4,10,6,或更大,七、核酸的性质和最常用的研究方法,（二）粘度,（三）酸碱性质,（四）紫外吸收,由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外有强烈吸收，最大吸收峰在260,nm,附近，利用这一特性可进行核酸的定量测定。,1紫外分光光度法,首先根据,A,260,/A,280,的比值判断核酸样品的纯度,纯DNA：A,260,/A,280,=1.8,纯RNA：A,260/A,280,=2.0,（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则,A,260,/A,280,比值明显降低）,纯的核酸样品可根据260,nm,的光吸收值算出其含量,若260,nm,光吸收值为1相当于50,g/ml,双螺旋,DNA,或相当于40,g/ml,单链,DNA,或,RNA,或相当于20,g/ml,寡核苷酸。,2摩尔磷消光系数（,molar,absorptivity,）,法,A：,样品的光吸收值,C：,每升溶液中磷的摩尔数,L,：,光径,在,pH7.0,时；,DNA,的 为6600,RNA,的 为77007800。,：摩尔磷消光系数，也称摩尔磷吸光系数,知道了磷的含量就可知核酸的含量,3增色效应与减色效应,增色效应（,hyperchromic,effect）,减色效应（,hypochromic,effect）,（五）沉降特性,1核酸浮力密度的测定,浮力密度：经密度梯度沉降平衡法测出的密度,氯化绝（,CsCl,）,密度梯度沉降平衡,用12个已知浮力密度的标准,DNA,样品作参考,式中,：,未知,DNA,的密度,0,：,标准,DNA,的密度,：,角速度（弧度/秒）,r：,未知,DNA,与转轴之间的距离,r,0,：,已知,DNA,与转轴之间的距离,2,DNA,中,G-C,含量的测定,G-C,对的含量与浮力密度之间呈正比关系,Rolfe,-,Meselson,导出了如下公式：,=0.100（G-C%）+1.658(g/cm,3,),知道了浮力密度就可计算出,G-C,对的含量,3核酸的构象和分离,：RNA,环状,DNA,线状,DNA,蛋白质,DNA,沉降,（六）核酸的变性、复性和杂交,1变性（,denaturation,）,核酸变性的概念,引起核酸变性的因素,（1）热变性,结构：螺旋线团,理化性质：紫外吸收,粘度比旋光度,生物活性：生物活性或丧失,（2）熔点（,Tm）,T,m,:,熔点，熔解温度，,变性温度，解链温度,（3）影响,Tm,值的因素,DNA,的均一性,DNA,中,G-C,对的含量,经验式:,(,G-C)%=(Tm-69.3)2.44,盐离子强度,2复性（,renaturation,）,（1）复性,理化性质:比旋光度 粘度,高于,Tm,值5,复性,也称退火,（annealing）,生物活性得到部分恢复,（2）影响复性的因素,样品的性质,DNA,的浓度,DNA,片段的大小,温度,离子强度,（3）复性动力学,DNA,的复性过程是一种双分子反应,S：single strand DNA,D：double strand DNA,经重排，积分等,式中,C,0,：t=0,时，起始,DNA,的浓度（,mol/L）,C：t,时间时，单链,DNA,的浓度（,mol/L）,k：,复性反应常数（,L/mol,sec）,t：,复性时间（,sec）,C,C,0,=,1,1+,kC,0,t,Cot :,时的,Cot,值，即指复性完成一半时的,Cot,值。,3杂交（,hybridization）,核酸的杂交：是指不同来源的单链核酸之间可通过,碱基互补形成双螺旋结构。,单链,DNA,与单链,DNA,杂交（,DNA-DNA）,利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研究同源性等。,单链,DNA,与单链,RNA,杂交（,DNA-RNA）,单链,RNA,与单链,RNA,杂交（,RNA-RNA）,用硝酸纤维素膜作为支持物进行杂交,1975年英国,E.M.Southern,首创的,Southern blotting（Southern,印迹）,原理,方法,探针：作为检测用的已知,DNA,序列或,RNA序列的片段,1977年,G.K.Stark,首创,Northern blotting,（Northern,印迹）,Western blotting（Western,印迹）,（七）凝胶电泳,核酸研究中最常用的方法,优点：简单、快速、灵敏、成本低。,通过凝胶电泳,（1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。,（2）测定分子大小。,（3）估计核酸的构象。,凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应,1琼脂糖凝胶电泳（,agarose,gel electrophoresis）,琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、核酸构象、电流等有关。,2聚丙烯酰胺凝胶电泳,（,polyacrylamide,gel electrophoresis）,用于分析,RNA,或,Mr,小于1000,bp,的,DNA,片段,适用于大分子核酸，一般用于,DNA,分析。,（一）,DNA,的生物功能,1,DNA,与遗传,（1）,DNA,是主要的遗传物质,间接证据,直接证据,八、核酸的生物功能,细菌转化作用（,transformation）,肺炎球菌（,pneumococcus,）,1928年细菌学家,Griffith,细菌毒性实验,1944年,Avery,细菌转化实验,转化作用：,转化作用的物质称转化因子,从一种细菌中得到,DNA,通过一定途径进入另一种细菌，从而引起后者遗传特性的改变。,噬菌体感染实验,1952年美国,Hershey,噬菌体感染实验,转导作用（,transduction,）,人工合成基因的表达,3.,DNA,与遗传性疾病、癌变的关系,（1）镰刀状红细胞贫血病的,DNA,点突变,（2）白化病的基因缺失,（3）癌变,（二）,RNA,的生物功能,1,RNA,与蛋白质的生物合成,（1）,mRNA,与遗传密码,遗传密码（,genetic code）,密码子（,codon,）,mRNA,的主要功能,（2）,tRNA,的作用,tRNA,的作用是多方面的，它接受氨基酸、携带氨基酸，把氨基酸转运到核糖体上，然后按照,mRNA,上的密码顺序装配成多肽或蛋白质。,tRNA,必须识别相应的氨基酸和识别,mRNA,上相应的密码子。,tRNA,怎样识别相应的氨基酸:主要靠高度专一的氨,酰-,tRNA,合成酶。,tRNA,怎样识别,mRNA,上相应的密码子,（3）,rRNA,的作用,详见网上参考材料,九、核酸的分离、纯化和核苷酸的制备,（一）核酸的分离、提取通则,为了得到完整的大分子核酸，一般要注意3点:,1保持低温（04）。,2防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌。,3防止核酸酶的作用。,抑制,DNase,：,可加柠檬酸钠、,EDTA,等金属螯合剂；或加去污剂 十二烷基硫酸钠（,SDS）；,或加蛋白变性剂。,抑制,RNase,：,（1）实验器皿高温，或高压灭菌，不能高压灭菌的用,具用0.1%二乙基焦碳酸盐（,diethyl,pyrocarbonate,DEPC）,处理。,（2）加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等。,（3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（,RNasin,）,等,RNase,的抑制剂。,（二）大分子,DNA,的提取,1材料的选择,2细胞破碎,3,DNA-,蛋白质（,DNP）,的提取,真核细胞,DNA,与蛋白质结合成核蛋白（,DNP），RNA,与蛋白质结合成,RNP，,而且,DNP,和,RNP,常常混在一起。利用,DNP,和,RNP,在不同浓度,NaCl,中溶解度的不同来分离,DNP,和,RNP。,可用1,mol/,LNaCl,溶液提取,DNP。,相,对,溶,解,度,NaCl,（mol/L）,DNP,在NaCl,中的溶解度,4去蛋白质,（1）,SDS,（2）苯酚法,（3）氯仿法,（4）酚:氯仿:异戊醇,25:24:1,5沉淀,DNA,6去杂质,（1）去,RNA,（2）去多糖,7进一步纯化,生物材料,DNP（RNP）,DNP,纤维状,DNA,较纯,DNA,纯DNA,*原核生物的,DNA,是裸露的，与蛋白质结合不多，分离纯化要简单些。,破细胞,1.0,mol/L,NaCl,*,去蛋白质,酒精沉淀,去RNA,柱层析，电泳,密度梯度离心,去多糖,（三）,RNA,的提取,1不同种类,RNA,的提取,2大分子,RNA,的提取,（1）酚提取,（2）酚-氯仿-,SDS,法,3,mRNA,的提取,4工业上制备,RNA,（1）稀碱法,（2）浓盐法,（四）核酸纯度鉴定,1.,A,260,/A,280,2.电泳,（五）核酸含量的测定,1.定磷法,2.定糖法,3.紫外吸收法,（六）核苷酸的制备,1碱水解,2酶水解,3.自溶法,