四环素类药物残留.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,高效液相色谱法测定鲜、冻禽产品中四环素类农药残留量,08,商检,3,班第十,组,常用于临床的四环素类抗生素有：金霉素、土霉素、四环素、强力霉素等,来源,土霉素由龟裂链丝菌、四环素由黑白链丝菌、金霉素由金色链丝菌的培养液提取而得，四环素还可用金霉素除去氯元素而获得。,性状,四环素类药物的抗菌作用，在碱性水溶液中下降，而在酸性水溶液中则稳定。四环素类药物分为金黄色或黄色晶粉，无臭，味苦，易溶于水，遇光则色渐变暗，故须密封、遮光，在干燥处保存。其水溶液的稳定性以四环素为佳，但一般均须以新鲜配制为宜，如不能立即用完应放于低温,(4,以下,),处保存。,作用与用途,四环素、土霉素、金霉素及多四环素为四环素类兽医专用药,该类药物为广,谱抗生素，具有良好的抑菌效果，因其价格便宜，目前仍广泛应用于畜禽、水生生物等产业领域。但由于不合理使用以及不遵守休药期,(WDT),等，造成该类药物及其降解产物残留于动物组织及畜产品中，必然会危及人类的健康。因此，为了控制四环素类药物在动物性食品中的残留，欧盟、美国及我国均规定了畜产品中四环素类药物的,最大残留限量为,0.1mg/L,。,四环素类药物,目前四环素类抗生素的含量测定方法有微生物法、高效毛细管区带电泳法、薄层色谱法及高效液相色谱法、,HPLC-MS/MS,等。本实验选择独特的样品处理方法，建立了一种快速、准确、分离度好的高效液相色谱法。,实验原理,色谱条件,美高效液相色谱仪色谱柱：,Hypersil ODS,（,C18,）柱,(1506.2mm,5m),；,流动相：,A,泵乙腈,-,水（,0.01mol/L),；,B,泵,0.01mol/L,磷酸二氢钠溶液（用,30%,硝酸溶液调节至,pH=2.5,），,35,：,65(A,：,B,使用前用超声波脱气,10min),；,流速：,1.0ml/min,；,柱温：室温；,灵敏度：,0.002AUFS,；,检测波长：,355nm,；,进样量：,10L,。,ODS-C18,样品经提取，微孔过滤膜过滤后直接进样，用反向色谱分离，紫外检测器检测，与标准比较定量，出峰顺序为土霉素、四环素、金霉素。,色谱柱的选择,用于分离四环素类化合物的色谱柱种类较多，包括,C18,柱、,C8,柱、,ODS,柱、苯基柱等，考虑到四环素类,物质在水中溶解度很小，且分子量很小，正相键合相,和反相键合相均可使用，但由于其分子中含酚羟基和烯,酸型羟基，具有一定极性，若选用正相键合相色谱柱，,可能会由于正相键合相的极性很大，二者的作用力很,强，造成洗脱困难，保留时间过长的情况，所以，选,择反相键合相更为适宜。加之，四环素类药物分子中,含酚羟基和烯酸型羟基显弱酸性，同时含有二甲胺基显,碱性，为两性化合物，在一定,pH,值下可以解离，在,反相键合相的条件下，调节,pH,值至合适范围，可获得,适宜保留值，达到满意分离。,本实验中选择了反相键合相色谱柱，并对,C8,和,C18,键,合相的分离能力进行了对比分析，结果表明,C18,色谱柱,分离效果较好。这可能是由于,C 1 8,色谱柱填料粒径小，,表面积大，柱效高，从而增强了溶质分子的分离度。加,之其有较高的,C,含量和更好的疏水性，对于各种类型的,样品分子具有更强的适应能力，所以在测定和分析禽产,品中四环素类药物多残留时可以优先考虑使用,C18,作为,实验用柱。,试剂与配制,土霉素,(0TC),、四环素,(TC),、金霉素,(CTC),标准储备液：,准确称取,0TC,、,TC,、,CTC,固体标准品各,0.0100g,，,0TC,、,TC,用,0.1mol/L,盐酸溶解定容至,10.00mL,，,CTC,溶于蒸馏水定容至,10.00mL,。此三种标准储备液含量为,1mg/mL(4,下可保存一周,),。,混合标准溶液：,取,0TC,、,TC,标准储备液各,1.00mL,，,CTC,标准储备液,2.00mL,，用蒸馏水定容至,1O ml,，此混合标准液中,OTC,、,TC,含量分别为,100g,ml,（,ppm,），,CTC,含量为,200g,ml,（,ppm,）,(,当天配制当天使用,),。,5%,高氯酸溶液,0.01mol/L,磷酸二氢钠溶液：,称取,1.56g,磷酸二氢钠溶于,100 mL,水中，用,30%,硝酸调节,PH,至,2.5,，经微孔滤膜过滤，超声备用。,乙腈,分析纯,样品预处理,将动物组织解冻，匀质，准确称取,5.00g(0.01g),置于,50ml,追星瓶中，加入,5%,的高氯酸溶液,25ml,，于超声波振荡器上振摇,10min,。以,2000r,min,高速离心,3min,，取上清液，经,0.45m,滤膜过滤，取,10L,进样，从工作曲线上查得含量。,工作曲线,分别称取,7,份切碎的肉样，每份,5.00g,（精确到,0.01g,）,分别加入混合标准溶液,0.25L,、,50L,、,100L,、,150L,、,200L,、,250L,（含土霉素、四环素各,0,、,2.5g,、,5.0g,、,10.0g,、,15.0g,、,20.0g,、,25.0g,）；按试样测定方法操作，以峰高为纵坐标，抗生素含量为横坐标，绘制标准曲线。,结果计算,x=,式中，,x,为样品中抗生素含量，,mg/kg,A,为样品溶液测得的抗生素质量，,mg,；,m,为样品质量，,g,。,操作步骤,这是在,GB/T20764-2006,中截取的标准物质色谱图，用的是液相色谱,-,紫外检测法。与书本所述方法有所区别，在这列出作为参考，出峰顺序依次为土霉素、四环素、金霉素。,参照,GB/T60764-2006,GB/T21317-2007,中测定四环素类兽药残留的相关方法，为使方法更为准确可靠，在原实验的基础上，可以再做回收率及精密度试验,回收率及精密度试验,：分别向,5mL,空白样品中添加混合标准溶液制成,0.05,、,0.1,、,0.2g,ml 3,种浓度的标准回收溶液，按上述样品处理和色谱条件进行回收率及精密度试验,(,每个添加做,5,个平行,),我说我见解,注意事项,1,）由于四环素类抗生素在生物品中易与蛋白质强烈结合，因此需要用强酸或酸性脱蛋白剂从生物制品中提取。,2,）四环素在酸性水溶液中紫外,270nm,处有最大吸收。,3,）不同,ph,值流动相条件下四环素类抗生素出峰效果不同，,ph,值越高，峰的拖尾现象越严重。酸性增强，各峰间的分离度增大，峰形越对称，但是过低的,ph,值会使填料柱水解，损坏柱子，故选用,ph,值,2.5,的乙腈与磷酸二氢钠溶液组成流动相，具有较好的峰形。,THE END,THANKS!,