高效液相色谱法测定甲硝唑的含量.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,药剂综合实验须知,实验项目,一 高效液相色谱法测定甲硝唑的含量,二 氨茶碱加样回收率实验,三 氨茶碱溶液稳定性实验,四 紫外分光光度计法测定氨茶碱含量,五 氨茶碱原料药稳定性实验,六 五味子散剂的制备,七,SOD,的含量测定,八 芦丁的提取和鉴别,实验要求,1,课前认真预习,，明确本次实验的目的、要求、内容、方法及步骤,2,提前,5-10min,进入实验室，检查实验所需物品是否齐全，,做好实验准备工作,。,3,实验时严肃认真,，根据实验指导要求进行操作，仔细观察和记录，并进行独立思考，,按时完成实验内容和实验报告。,4,保持实验室安静,，实验时不得随意走动和谈笑。室内严禁吸烟、不允许在实验室内接听手机,.,5,保持实验室清洁整齐,，书包、衣帽等应放在指定位置，不能置于实验台上；一切实验用具用完后擦洗干净，放回原处。,6,爱护,实验室一切仪器设备，,珍惜,药品及一切消耗用品,(,如纱布、拭镜纸、载玻片等,),，,节约,水、电。按操作规程使用显微镜、解剖镜等，使用前要检查，使用后要擦拭整理，如发现损坏或故障应及时报告指导教师。,7,实验完毕后，,值日生值日,。值日工作范围包括：关闭水、电、门、窗；检查仪器，显微镜是否完好；查看水池，实验台，桌椅，地面是否干净整齐；最后在值日生记录本上登记值日情况，再交于老师签字后方可离开。,考核办法,实验习惯,10,：,迟到,1,次扣,1,分，旷课一次扣,3,分，值日生必须最后走，早走者扣,1,分。,预习报告,10%,：,不能简单抄书，要学会总结归纳。,实验报告,20,：,当堂绘图，,当堂交报告，迟交报告者要扣分。,实验操作,30%,：,要能独立完成实验；实验结果必须交老师检查；出现重大失误者要扣分,实验考试成绩,30,：,操作,10%,，笔试,20%,迟到、早退、缺一次实验以上者或考试不及格者均不能得优秀，缺两次实验的不能得良好，缺该课程,1/3,以上者或不参加实验考试者，均没有实验成绩。,实验报告的书写格式：,（,1,）实验名称,（,2,）实验目的3,）实验内容及步骤,（,4,）实验结果,实验一 高效液相色谱法测定 甲硝唑的含量,高效液相色谱仪的主要结构及功能简介,1.,高压输液泵,2.,进样器,3.,高效分离柱,4.,液相色谱检测器,5.,记录仪,(1),高压输液泵,主要部件之一，压力：,150,350,10,5,Pa,。,注意排气泡：,purge,流速设置,（,2,）进样器,样品液吸取方法：上下反复抽取液体，速度稍快，直到肉眼看不见气泡为止，水平持进样针（液体吸取数量,可多余,20,L,），注入进样器。,进样器存在的两个位置：,load,（右上）,和,inject,。,(2),高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，,C18,柱,标准内径及柱长为,4.6*150mm,或,4.6*250mm,，,填料,颗粒粒度,5m,。,色谱柱,pH,值范围不同：,酸性柱、碱性柱、中性柱。,安装方向,柱温箱：保持温度稳定。,(3),液相色谱检测器,a.,紫外检测器,b.,光电二极管阵列检测器,c.,示差折光检测器,d.,荧光检测器,e.,电导检测器,紫外检测器,紫外检测器对占物质总数,约,80%,的物质（有机和部分无机物质）均可检测，既可测,190-350 nm,范围的光吸收变化，也可向可见光范围,350-700 nm,延伸。,优点：应用最广，灵敏度高，线性范围宽。是高效液相色谱仪的,标准配置,。它的最重要特征是对流动相的流速（脉冲）和温度变化不敏感，可用于,梯度洗脱,。,缺点：对,无紫外吸收的组分,不响应，而对紫外吸收较大的溶剂如,苯,不能作流动相使用。,高效液相色谱的主要分离方法,液相色谱根据,固定相性质,可分为以下几种：,吸附色谱,(Adsorption Chromatography),键合相色谱,（,Bonded phase chromatography,）,离子交换色谱（,Ion Exchanger,Chromatogr,.,）,空间排阻色谱（,Size Exclusion,Chromatogr,.,）,亲合色谱（,Affinity Chromatography,）,在以上五种分离方式中，,反相键合相色谱,应用最广，因为它采用,醇,水,或,腈,水,体系作流动相。纯水易得廉价，它的紫外吸收极小。在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广的反相键合相是,十八烷基键合相,，即让十八烷基（,C18H37,）键合到硅胶表面。这种键合相又称,ODS,（,Octadecylsilyl,）键合相，如国外的,partisil5-ODS,、,Zorbax,-ODS,、,Shim-pack CLC-ODS,，国产的,YWG-C18,等。,实验目的,熟悉高效液相色谱仪主要结构组成及功能；,了解反相色谱法的原理、优点和应用。,了解流动相的选择依据及配制方法；,掌握高效液相色谱法进行定性和定量分析的基,本方法。,实验原理,高效液相色谱法是采用,高压输液泵,将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。本实验以甲硝唑为测定对象，以,反相,HPLC,来分离,检测未知样中甲硝唑的含量,。以甲硝唑标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度进行线性回归，再根据样品中甲硝唑的峰面积，由线性方程计算其浓度。,实验器材与材料,实验器材：,高效液相色谱仪、精密天平、,50ml,烧杯、玻璃棒、称量纸、,10ml,容量瓶、,50ml,容量瓶、注射器、洗瓶、,EP,管、滤膜。,实验材料：,甲硝唑原料、蒸馏水、,HCl,、乙腈、三氟乙酸、超纯水。,0.1M,HCl,溶液配制：,准确量取,HCl,溶液,8.3ml,用蒸馏水定容至,1000ml,，即得。,实验步骤,色谱操作条件,;,标准溶液配制；,标准曲线的建立；,样品溶液的配制；,甲硝唑样品含量测定。,色谱柱：,C18,柱（,1504.6mm,5m,）；,流动相：乙腈：,0.02%,三氟乙酸水溶液（,20,：,80,）,流速：,1mL/min,检测波长：,277nm,柱温：,35,进样量：,20,L,1.,色谱操作条件：,2.,标准溶液配制,精密称取在,105,条件下干燥至恒重的甲硝唑对照品,10mg,，置于,50mL,容量瓶中，用,0.1M,HCl,溶液溶解并定容至刻度，即得浓度为,0.2mg/mL,的甲硝唑标准储备液，备用。,3,、标准曲线的建立,精密量取甲硝唑标准储备液分别为,0.3ml,、,0.5ml,、,0.7ml,、,0.9ml,、,1.1ml,置于,10ml,的容量瓶中，然后用,0.1M,HCl,溶液定容至刻度，得到浓度梯度为,6g/mL,、,10g/mL,、,14g/mL,、,18g/mL,和,22g/mL,的标准溶液，,分别过,0.22,m,的微孔滤膜过滤，滤液置于,1.5ml,的,EP,管中并标号，,各进样,20L,检测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。,线性要求：,色谱峰,分离度大于,1.5,，浓度点,n,5,。用浓度,c,对峰面积,A作线性回归处理，得一直线方程，,r,应,大于,0.999,，方程的截距应近于零。,4.,样品溶液的配制,精密称取甲硝唑原料药,10mg,，置于,50ml,容量瓶中，用,0.1M,HCl,溶液溶解并定容至刻度，摇匀，再从中取出,0.7ml,定容至,10ml,，即得甲硝唑样品溶液。,5.,甲硝唑样品含量测定,用注射器吸取已配制好的甲硝唑样品溶液适量，,过,0.22,m,的微孔滤膜过滤，滤液置于,1.5ml,的,EP,管中并标号，,再从中吸取,20L,注入液相色谱仪，采用高效液相色谱法在,277nm,波长处测定溶液中甲硝唑峰面积，最后通过标准曲线计算样品中甲硝唑的含量。,实验结果,1.,标准曲线方程及绘制,2.,甲硝唑样品含量,