1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,考马斯亮蓝法测定,蛋白质含量,一、实验目的。,掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原理与方法。,熟练分光光度计的使用和操作方法,。,双缩脲法和,Folin,酚试剂法的明显缺点和许多限制,，,促使科学家们去寻找更好的 蛋白质溶液测定的方法。,1976,年由,Bradford,建立的考马斯亮兰法（,Bradford,法），是根据,蛋白质与染料相结合,的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。,考马斯亮蓝法出现背景,二、实验原理,考马
2、斯亮兰,G-250,染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的,最大吸收峰的位置,，由,465nm,变为,595nm,，溶液的颜色也由,棕红色变为蓝色,。经研究认为，染料主要是与,蛋白质,中的碱性,氨基酸,（特别是精氨酸）和芳香族,氨基酸,残基相结合。,在,595nm,下测定的吸光度值，,与,蛋白质,浓度成正比,实验优点,（,1,）,灵敏度高。,据估计比,Lowry,法约高四倍，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比,Lowry,法要大的多。,（,2,）,测定快速、简便，只需加一种试剂,。完成一个样品的测定，只需要,5,分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要,
3、2,分钟即可完成，其颜色可以在,1,小时内保持稳定，且在,5,分钟至,20,分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像,Lowry,法那样费时和严格地控制时间。,（,3,）,干扰物质少,。如干扰,Lowry,法的,K,、,Na,、,Mg2,离子、,Tris,缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、,EDTA,等均不干扰此测定法。,实验缺点,（,1,）,Bradford,法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。,在制作 标准曲线时通常选用,g,球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。,（,2,）,标准曲线也有轻微的非线性。,因而不能用,Beer,定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。,三、
4、实验器材与试剂,器材。,可见分光光度计、试管、试管架、研钵、离心机、离心管、,10ml,容量瓶、刻度移液管、移液枪、小麦叶片或绿豆下胚轴。,试剂。,0.9,生理盐水,考马斯亮蓝试剂,称取,考马斯亮蓝,G250 100,，加,95,乙醇,100ml,，溶解后加,85,H,，,100,ml,，加水稀释至,1000ml,，存于棕色瓶。,蛋白质标准溶液,准确称取经微量凯氏定氮法校正的,结晶牛血清清蛋白,，配置,1000,g/ml,标准溶液。,四、实验步骤,标准曲线的制作,取试管,6,只，按下表进行编号并加入试剂，充分摇匀,。,1,2,3,4,5,6,V,（标准蛋白溶液）,l,0,20,40,60,80
5、100,V(0.9,生理盐水）,l,100,80,60,40,20,0,(,蛋白质含量）（,g,0.1ml),0,20,40,60,80,100,试管编号,试剂,每支试管加入,3ml,考马斯亮蓝试剂,振荡混合后放置,5,分钟,于,595nm,测定吸光度,A595,为纵坐标、标准蛋白含量横坐标,绘制标准曲线,样品提取液中蛋白质含量的测定,取,3,支试管，各吸蛋白提,取液,0.1ml,，分别加考,马斯亮蓝试剂,3ml,振荡混合放置,5,分钟,以制作标准曲线的,1,号试管,做空白对照，,595nm,测吸光度,据所测,A595,值，于标准曲线,上查出相当标准蛋白的量，取,三重复样品蛋白含量均值,结果
6、计算,样品蛋白质含量,=,g,g,鲜重,m,为从标准曲线查得的蛋白质含量。,m(,g),提取液总体积（,ml,）,所取提取液体积,样品鲜重（,、标准比较法,取三只试管，按下表操作,试管编号,试剂,待测管（,U),标准管（,S),对照管（,B),V(,样品提取液）,ml,0.1,_,_,V,（蛋白质标准液,)ml,0.1,V(0.9,生理盐水）,ml,_,0.1,V,（考马斯亮蓝试剂）,3.0,3.0,混匀放,5min,3.0,A,595,调零,样品蛋白质提取液含量,m(,g)=Au,As100,五、注意事项,待测液中蛋白质浓度不可过高或过低，应控制在,100800,g,ml,为宜。,比色测定时，考马斯亮蓝易吸附在比色皿表面，对后续测定造成影响，因此测定结束后用无水乙醇清洗比色皿。,预期结果,Brandford,染色液和蛋白液在酸性条件下结合，溶液颜色由棕黑色转为蓝色。,
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