RNA剪接1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,RNA,拼接（,RNA splicing,）,：,一个基因的外显子和内含子共同转录在一条转录产物中，将内含子去除而把外显子连接起来形成成熟,RNA,分子的过程,拼接点：,5,拼接点,或左拼接点（内含子上游）,3,拼接点,或右拼接点（,下游）,2,、内含子的分类,1982 Davies,等人,中部核心结构,（,central core structure,）,:,在有些内含子,中，含有,4,个重复的保守序列，长度为,10 20bp,，,4,个保守序列,构成一种,二级,结构,，在拼接中起重要作用,由于并非所有的内含子都有中部核心结构，所以有了内含子的分类,类内含子,（,group,）,:,含有中部核心结构,细胞器基因 核基因,类内含子,（,group,）,:,不含有中部核心结构,细胞器线粒体基因内 核基因,类内含子,（,group ,）,:,具有,GU,AG,特征的边界序列,核基因,mRNA,前体,tRNA,基因的内含子,均位于,tRNA,的反密码环上,四种内含子的边界序列各有一定共同的特征,3,、拼接方式,方式一,：由,拼接装置,完成（核,mRNA,内含子）,可供识别的特异序列,拼接装置由,多种蛋白质,和,核蛋白,组成,方式二,：,自我拼接,（两类内含子,、,）,形成特定的二级结构,RNA,具有催化拼接的能力,方式三,：需要,蛋白质酶,参与的拼接（酵母,tRNA,）,前两种拼接都属于,转酯反应,二、,tRNA,的拼接（酵母为例）,1,、,链的断裂,和,连接,是,两个独立的,过程,2,、,tRNA,的内含子均位于反密码环的,3,端，,与反密码子相距,一个,Nt,长,14,16bp,，,其中含一段与反密码环互补的序列,反密码环处形成一个与成熟,tRNA,不同的构象,酵母,tRNA,phe,4,、拼接过程,研究方法,构建温度敏感突变体（高温时,.,）,分离累积,tRNA,前体,体外加入野生型细胞抽提液,研究,拼接过程,第一步：内切酶作用,释放一条,线状内含子,分子,和两个“,tRNA,半分子两个,tRNA,半分子采取,成熟,tRNA,分子的,构象,拼接过程,第二步：,RNA,连接酶连接断端,其中 内切酶作用后产生,5OH,和,3,磷酸,，,3,磷酸端很快转,变为,2,，,3,环式核苷酸,因此，一个半分子有,两个磷酸末端,，一,个半分子有,两个,OH,末端,连接反应前要进行两个反应：,a,、,左外显子的,3,端成为,OH,（,环式磷酸二酯酶）,其,3,位为,OH,，,2,位为磷酸,b,、,第二个外显子的,5,端转变为,磷酸基,（多聚核苷酸激酶）,因此,连接后还要,切除,第一个外显子的,2,磷酸,这是,tRNA,内含子拼接重要特点之一,前体,RNA,两个半分子,进行两个连接反应成熟,tRNA,三、第,类内含子的拼接,特点：,拼接属于,自我拼接,形成明显的,二级结构,1,、结构特点：,（,1,）,5,拼接点和,3,拼接点,-U,G,5,exon,U,intron,G,exon,3,（,2,）,有由保守序列形成的二级结构,a,、,保守序列为,5,P,Q,R,S,3,距拼接点很远，各,10,12bp,P,与,Q,互补、,R,与,S,互补而形成中部核心结构,b,、,二级结构中还包括内含子与外显子的某一序列互补所形成的二级结构,内部引导序列,（,interal,guide sequence IGS,）：,内含子,中能与,两个拼接点边界,序列配对的一段序列,#,第一类内含子的拼接依赖于以上二级结构,为自我拼接的进行提供,活性位点,2,、拼接机制,（以四膜虫的大,rRNA,前体的拼接为例）,（,1,）两种,rRNA,转录在一条,35S,的产物中，,26SrRNA,有内含子,5 U G 3,小,rRNA,大,rRNA,（,26S,有内含子）,（,2,）,35SRNA,体外有自我拼接的能力,反应需要：,一价和二价离子,鸟苷酸辅助因子,（,G,TP GDP GMP,和,鸟嘌呤核苷）,不需能量的供给,（,3,）拼接反应后，,G,与内含子,（,414base,）,5,端以磷酸二酯键相连 （放射性标记试验）,（,4,）具体的拼接过程,第一步：游离,G,发动的转酯反应,G,的,3OH,攻击内含子的,5,拼接点,G-,内含子、左外显子（有游离,3OH,）,第二步：游离外显子（左）发动的转酯反应,左外显子的,3-OH,攻击,3,拼接点，同时释放,线状的内含子,形成成熟,RNA,分子,两次转酯反应是,紧密偶联,的,释放出的内含子可继续进行,转酯反应,而形成,环状,（,5,）,自我拼接,过程主要由,转酯反应,构成，且完全由内含子自身完成,-,自我拼接的最大特点,转酯反应是将一处已有的磷酸二酯键变成另一处新的 磷酸二酯键,内含子自身能形成特定的,二级结构,，产生适于拼接反,应的,构象,和,活性位点,在,G,的参与下完成拼接反应,(,内部引导序列,),这一机制如下图所示,:,科罗拉多大学,Cech,等人完成（美）,活性位点,3,、内含子的催化功能,35SRNA,前体拼接释放的,内含子,（,414base,）,进行的自身转 酯反应,（,1,）,线状分子,自身,环化,能力及环化后的,逆环化,A 16,（线性片段）,U20,(,线性片段,),逆环化,逆环化,（,2,）,C15:,逆环化,将,UUU,加到,5,端的能力,表明,:,该环形产物具有连接两个,RNA,分子的能力,（,3,）,L19,：,具有酶活性,即,Cech,等人证明的,L19,的,polyC,聚合酶活性,L19,分子,L19,分子,（,4,）总结：,a,、,四膜虫的,35SRNA,的内含子有,自身催化,的性质即,-,将一处已有的磷酸二酯键转变成另一处新的磷,酸二酯键，不需要额外的能量,因此：,内含子可以看作是,RNA,重排酶,（,RNA,rearrangease,）,或,RNA,异构酶,（,RNA,isomerase,）,其中：,拼接反应中，,“酶”和底物是同一个分子,，且反应后,变成了不同的分子,b,、,L19,的,polyC,聚合酶活性,进一步表明,L19,具有酶的,主要特征：,专一性强,加快反应速度,反应前后酶分子保持不变,人们称这种由,RNA,构成的酶为,-,核糖核酸质酶（,ribozyme,）,可简称,R,酶,四、第二类内含子的拼接,1,、拼接点序列,7,核苷酸的保守序列,（,Branch Site,）,3,拼接点上游,6bp,12bp,处,5-exon-,GUGCG-,-B.S-,Py,AU,-exon-3,供点,受点,-,Py,Pu,Py,Py,U,A,Py,-,100%,在,Branch Site,的两侧存在一些短的序列，,与其上游,10-50Nt,处互成,IR,形成茎环结构,(,但,A,不包含在,IR,序列内,从而被排除成芽状突起）,5-GUGCG-PyPuPyPyU,A,Py-Py,AU,3,Intron,IR IR,5 G AU 3,A,2,、拼接机制（,Splicing mechanism,）,Int,ron,IR IR,A,5 G AU 3,Exon,1 Exon2 G A,intron,PyAU,Matural,RNA,“,Lariat,”,intron,套索状内含子,转酯攻击位点,intron,OH AU,2,A,3,G,五、核基因,mRNA,内含子的拼接,1,、相关概念,Euk,.,的细胞中，有许多碱基数在,100,300,之间,的小分子,RNA,每个细胞有,10,5,10,6,个,snRNA,：,细胞核中的 （,snRNP,）,scRNA,：,细胞质中的,（,scRNP,）,2,、核,mRNA,内含子拼接的结构特点,内含子拼接与其他加工同时进行,拼接点序列,Breathnach-Chambon,rule,（,GU,AG,规则）,5-,-exon,-GU-,intron,-AG-,exon-,-3,供点,100%94%,受点,7Nt branch site 3,拼接点的上游,py,X,py,U,pu,A,py,3,、拼接机制（,Splicing,mehanism,),SnRNA,(or,ScRNA,),与拼接点序列间存在,互补区域,并参与剪接,形成,拼接体,(,spliceosome,),。,Spliceosome,逐级组装，,SnRNA,（,U,1,、,U,2,、,U,5,和,U,4,U,6,）,分步替代,U1,通过与,5,拼接点,互补而结合,U2,识别,并结合,分支,点,A,U1,和,U2,作用使内含子的,5,端和,3,端带到,一起（,U1,与,3,拼接点配对）,U1,、,U2,、,mRNA,与,U4,U5,U6,复合物形成一个完整的拼接体,第一次转酯左外显子、内含子剪切套索,lariat,第二次转酯,exons,连接、套索状内含子释放,拼接体（,spliceosome,）,解体与,lariat,降解同步,名词解释,转录 启动子,RNA,拼接 左、右拼接点 不连续转录,反式拼接 转录终止子,简答题,1,、说明,RNApol,全酶各个亚基的主要功能。,2,、以,E.coli,为例，说出,Prok,.,启动子结构及各部分功能。,3,、以,Prok,.,为例简述转录起始过程。,4,、终止子和终止密码子有何区别？,5,、试述,Prok,.,中转录终止子的类型及终止机制。,6,、解释,E.coli,的,噬菌体调控不同发育阶段基因表达的抗终止机,制。,7,、简述内含子的种类及拼接方式,8,、说明,tRNA,内含子拼接的简单步骤和特点。,9,、,tRNA,基因的类型及各类型的前体在加工过程中所要解决的,问题。,10,、说明,poly(A),在分子生物学实验中的应用价值。,11,、为什么在细菌（,Prok,.,）,中很少涉及到,因子？,12,、,Euk.mRNA,帽子的种类。,13,、以四膜虫的大,rRNA,前体的拼接为例，说明第,类内含子拼接的简单过程及特点。,