第十六章-高效液相色谱法.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,16-1,高效液相色谱法的特点,feature of HPLC,特点：高压、高效、高速,高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,第1页，共32页。,16-2,高效液相色谱仪,流程及主要部件,第2页，共32页。,(1)高压输液泵,主要部件之一压力：15035010,5,Pa,。,为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),（,2,）溶剂要与检测器匹配,。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外,截止波长,要长。,对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。,第13页，共32页。,（,3,）高纯度,。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加,50,IOOnm,。,（,4,）化学稳定性好,。不能选与样品或固定相发生反应或聚合的溶剂。,（,5,）,低粘度,。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离,.,（,6,）试样在流动相中应有适宜的溶解度，试样在流动相中应有适宜的溶解度。,第14页，共32页。,一、液-固吸附色谱,二、液-液分配色谱,三、化学键合相色谱,四、离子交换色谱,五、排,阻色谱,六、亲和色谱(,AC),主要分离类型与原理,第15页，共32页。,16-3,液-固吸附色谱,liquid-solid adsorption,chromatography,固定相,：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510,m,的硅胶吸附剂；,流动相,：各种不同极性的一元或多元溶剂。,基本原理,：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；,适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；,缺点,：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；,第16页，共32页。,16-4,液-液分配色谱,liquid-liquid partition,chromatography,固定相与流动相均为液体（互不相溶）；,基本原理,：,组分在固定相和流动相上的分配,；,流动相,：,对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（,正相,normal phase），,流动相的极性大于固定液的极性（,反相,reverse phase）。,正相与反相的出峰顺序相反；,固定相,：,（1）全多孔型载体,（2）表面多孔型载体（薄壳型微珠担体）,第17页，共32页。,16-5,化学键合相色谱,bonded-phase chromatography,1,键合固定相类型,用来制备键合固定相的载体，几乎都用,硅胶,。利用硅胶表面的硅醇基,(Si,一,OH),与有机分可成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类,（,1,）,疏水基团,如不同链长的烷烃（,C,8,和,C,18,）和苯基等,（,2,）,极性基团,如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。,（,3,）,离子交换基团,如作为阴离子交换基团的胺基，季镀盐；作为阳离子交换 基团的磺酸等,.,第18页，共32页。,16-5,化学键合相色谱,bonded-phase chromatography,2.,化学键合固定相,特点：,（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；,（2）,寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；,（,3,）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；,（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；,（5）有利于梯度洗脱；,适用于分离容量因子,k,值范围宽的样品。,存在着双重分离机制：,(键合基团的覆盖率决定分离机理),高覆盖率：分配为主；,低覆盖率：吸附为主；,第19页，共32页。,3,反相健合相色谱法,固定相：,极性较小的键合固定相，如硅胶,-,C,18,H,37,、硅胶,-,苯基等；,流动相：,极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛,-,水、水和无机盐的缓冲溶液等。,多用于分离多环芳烃等低极性化合物；具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。,分离机理：,疏溶剂作用。把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“,分子毛,”，这种“分子毛”有较强的疏水特性。当用极性流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时，一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。显然，两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。,第20页，共32页。,4.,正相键合相色谱法,固定相,:,极性的有机基团，,CN,、,NH,2,双羟基等键合在硅胶表面；,流动相,:,而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腊等）为分离极性化合物。,主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。,5.,离子性键合相色谱法,固定相,:,当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合各种离子交换基团，如一,SO,3,H,一,CH,2,NH,2,、,C00H,、一,CH,2,N,（,CH3,）等；,流动相,:,一般采用缓冲溶液。,分离原理与离子交换色谱类同,。,第21页，共32页。,16-6,离子交换色谱,ion-exchange,chromatography,固定相,：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；,流动相,：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；,基本原理,：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；,阳离子交换：,RSO,3,H +M,+,=RSO,3,M +H,+,阴离子交换：,RNR,4,OH +X,-,=RNR,4,X+OH,-,应用,：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。,第22页，共32页。,3.,离子交换色谱,分离固定相,结构类别：,（1）薄壳型离子交换树脂,薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；,（2）离子交换键合固定相,薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）,树脂类别：,（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）,（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）,第23页，共32页。,16-7,排阻色谱色谱,size-exclusion chromatography,固定相,：,凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理,：,按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。,全部在死体积前出峰；,可对相对分子质量在100-10,5,范围内的化合物按质量分离,第24页，共32页。,空间排阻分离固定相,（1）软质凝胶,葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；,水为流动相。适用于常压排阻分离。,（2）半硬质凝胶,苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；,非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂,（3）硬质凝胶,多孔硅胶、多孔玻珠等；,化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。,可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。,第25页，共32页。,16-8,亲和色谱(,AC),Affinity,chromatograph,原理,：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。,先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。,第26页，共32页。,16-8,色谱分离方法的选择,第27页，共32页。,HPLC,的,应用,application of HPLC,1.环境中有机氯农药残留量分析,固定相,：,薄壳型硅胶(37,50,m),流动相：正己烷,流 速：1.5,mL/min,色谱柱：50cm,2.5mm(,内径),检测器：差示折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,第28页，共32页。,2.稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质。,固定相,：,十八烷基硅烷化键合相,流动相：20%甲醇,-,水 100%甲醇,线性梯度淋洗，2%/,min,流 速：1,mL/min,柱 温：50,C,柱 压：70,10,4,Pa,检测器：紫外检测器,第29页，共32页。,16-9,毛细管电泳（,capillary electrophoresis,）,1.,电泳,在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为,电泳,。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。,1981年，,Jorgenson,和,Luckas，,用75,m,内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/,m，,促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与,GC、HPLC,相媲美的崭新的分离分析技术,高效毛细管电泳（,HPCE,）,。,第30页，共32页。,2.,HPCE,中的电渗现象与电渗流,石英毛细管柱，内充液,pH3,时，表面电离成-,SiO,-,管内壁带负电荷，形成双电层。,在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度,电渗流,。,第31页，共32页。,3,.,HPCE,中电渗流的作用,电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍；,各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：,+,=,电渗流,+,+ef,阳离子运动方向与电渗流,一致,；,-,=,电渗流,-,-ef,阴离子运动方向与电渗流,相反,；,0,=,电渗流,中性粒子运动方向与电渗流一致；,（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；,（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变,LC,中的流速；,（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；,在,HPCE,中，控制电渗流非常重要,。,第32页，共32页。,