【实验】培养基的配制和灭菌.pptx

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物品，,160,170 1,2,小时,接种环、接种针等 金属用具,7075,、,30min,80,、,15min,100,、,56min,消毒,灭菌,定义,方法,较为,温和,理化方法，,杀死,部分有害菌体,（,不,包括芽孢、孢子）,强烈,的理化方法，,杀死,所有微生物,（包括,芽孢、孢子,）,煮沸消毒法,巴氏消毒法,化学药剂,紫外线,灼烧灭菌,干热灭菌,酒精、氯气、石炭酸等,高压蒸汽灭菌,培养基，,100KPa,、,121,、,15,30min,关键是防止外来杂菌的污染,2,.,消毒与灭菌：,二、无菌技术,四、大肠杆菌的纯化培养,分散成单个细胞,形成单个菌落,3.,功能：,单个,或少数菌体,2.,特征：,大小、形状、光泽度、,颜色、透明度等。,鉴定菌种,的重要依据,固体,培养基上,大量繁殖,子细胞群体,(,菌落,),1.,定义：,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.,计算：,培养基用量,依配方计算各成分的用量,2.,称量：,3.,溶化：,牛肉膏黏稠，用称量纸称取,牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖,牛肉膏、称量纸、少量水加热溶解,取纸,蛋白胨、,NaCl,琼脂,补水定容,4.,调,pH,、分装、封口：,5.,灭菌：,6.,倒平板：,培养基、培养皿,倒平板约,50,倒置：防止皿盖上的水珠,落入培养基，造成污染,灼烧灭菌，,防止瓶口的微生物污染培养基,倒置,1.,培养基灭菌后，需要冷却到,50,左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.,为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.,平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,思考讨论 （课,P17,）,4.,在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,学生看课,P18,平板划线法的操作,在给学生看平板划线法的视频,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,纯化大肠杆菌：,接种方法,:,平板划线法：,菌种,划,3,个平板,1,个不划线,1.,接种：,接种环,防止划破培养基？,（重复实验）,（空白对照）,四、大肠杆菌的纯化培养,平板划线时不能划破培养基，为什么？,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；,二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,问题讨论,1.,为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物,杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。,及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,操作的第一步灼烧接种环：,每次划线之前都要灼烧接种环,：,在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环,：,第一次灼烧,每次划线之前灼烧,划线结束灼烧,目的,避免接种环上,可能存在的微,生物污染培养,物,杀死上次划线结束,后残留在接种环上,的菌种，使每次划线,的菌种均来自上次,划线末端,杀死接种环上残,留的菌种，避免细,菌污染环境和感,染操作者,灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太,高杀死菌种。,划线时最后一区域不要与第一区域相连。,问题讨论,问题讨论,2.,在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,3.,在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,6,支试管，分别加入,9ml,无菌水,1ml,10,1,1ml,10,2,1ml,10,3,1ml,10,4,1ml,10,5,1ml,10,6,接种方法,:,稀释涂布平板法：,a.,梯度稀释菌液：,菌液,微量 移液器,稀释涂布平板法：,a.,梯度稀释菌液：,b.,涂布平板：,不超过,0.1ml,1,个不涂布作空白对照,滴,灼,冷,涂,稀释,10,3,倍,稀释,10,4,倍,稀释,10,5,倍,各梯度分别涂布,3,个平板,(,重复组，取平均值,),平板划线法,稀释涂布平板法,：,问题讨论,涂布平板的所有操作都应该在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2,步应如何进行无菌操作？,答：应从操作的各个细节保证“无菌”，例如，酒精灯与培养皿的距离要合适，吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围，等等,平板划线法：,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,纯化大肠杆菌：,1.,接种：,稀释涂布平板法：,2.,培养：,将,接种后,的培养基和一个,未接种,的培养基,放入,37,恒温箱,中培养,12h,24h,后，,观察并记录,四、大肠杆菌的纯化培养,接种方法,下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是,(),A.,防止杂菌污染,B.,消灭杂菌,C.,培养基和发酵设备都必须灭菌,D.,灭菌必须在接种前,B,灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌而是消灭全部微生物。,灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。,灭菌的目的,发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的,五、课题成果评价,培养,12 h,与,24 h,后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点。,（一）培养基的制作是否合格,如果,未接种的,培养基在恒温箱中保温,1,2 d,后,无菌落生长，,说明培养基的制备,是成功的,，否则需要重新制备。,（二）接种操作是否符合无菌要求,如果培养基上生长的,菌落的颜色、形状、大小基本一致,，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明,接种操作是符合要求的,；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。,（三）是否进行了及时细致的观察与记录,1.,临时保藏：,试管固体斜面培养基上,4,2.,长期保存：,菌种易被污染、变异,甘油管藏,1ml,甘油,1ml,菌液,20,六、课题延伸（菌种的保藏）,本课题知识小结,微生物的实验室培养,培养基,无菌技术,制备牛肉蛋白胨固体培养基,纯化大肠杆菌,结果分析与评价,培养基的类型,培养基的营养物质,避免杂菌污染的方法,实验室常用的消毒方法,实验室常用的灭菌方法,平板划线法,稀释涂布法,（步骤）,编号,成分,含量,粉状硫,10g,（,NH,4,）,2,SO,4,0.4g,K,2,HPO,4,4.0g,MgSO,4,9.25g,FeSO,4,0.5g,CaCl,2,0.5g,H,2,O,100ml,例,3,右表是某微生物培养基成分，请据此回答：,（,1,）表中营养成分共有,类。,（,2,）右表培养基可培养的微生物类型是,。,自养型微生物,3,（,3,）若除去成分,（,NH,4,),2,SO,4,，加（,CH,2,O,），该培养基可用于培养,。,（,5,）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行是,。,（,6,）右表中各成分重量确定的原则是,。,（,7,）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是,。,固氮微生物,调整,pH,依微生物的生长需要确定,琼脂（或凝固剂）,课题,2,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1,、尿素的利用,尿素,是一种重要的,农业氮肥。,尿素,不能直接,被农作物,吸收。,土壤中的细菌将尿素,分解成氨,之后才能被植物利用。,2,、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们,能合成脲酶,CO(NH,2,),2,脲酶,+CO,2,2NH,3,+H,2,O,尿素是,培养基中的,唯一氮源,，,只有能合成,脲酶,的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源，才能生长。,缺乏,脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,5,、该培养基选择分解尿素的微生物的原理,选择培养基：,在微生物学中，将,允许,特定种类的微生物生长，同时,抑制或阻止,其他种类微生物生长的培养基。,1,、显微镜直接计数：,利用,血球计数板,，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.,统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌；,不适于对运动细菌的计数；,需要相对高的细菌浓度；,个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,2.,间接计数法（,活菌计数法）,原理：,在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的,一个菌落,是由,一个单细胞,繁殖而成的，即,一个菌落代表原先的一个单细胞。,常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数,(CV)M,其中，,C,代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，,V,代表涂布平板时所用的稀释液的体积,(ml),，,M,代表稀释倍数。,注意事项,为了保证结果准确，一般选择菌落数在,30,300,的平板上进行计数。,为使结果接近真实值可将同一稀释度加到,三个或三个以上,的平皿中，经涂布，培养计算出菌落,平均数,。,(,即设置重复组求平均数,),统计的菌落往往比活菌的,实际数目低,。,（一）土壤取样,（二）制备培养基,（三）土壤样品的稀释,（四）取样涂布,（五）微生物的培养与观察,（八）鉴定,（七）细菌的计数,二,.,实验的操作流程,选择培养基（尿素培养基）,牛肉膏蛋白胨培养基,(,作对照,),（六）鉴定,：筛选后必鉴定,鉴别培养基,：,加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存,1,、酚红培养基：,鉴定分解尿素的细菌,。,原理：,脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红脲酶阳性,2,、伊红,美蓝培养基：,鉴定大肠杆菌,原理：,代谢产物与伊红,美蓝结合 菌落呈黑色并带有金属光泽。,CO(NH,2,),脲酶,+CO,2,NH,3,+H,2,O,属鉴别培养基，它并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长,操作,实验组,对照组,判断培养基中是否有杂菌污染,判断选择培养基是否具有筛选作用,选择培养基,接种,选择培养基,不接种,选择培养基,接种,牛肉膏蛋白胨培养基,接种,需将,未接种的选择培养基,同时进行培养,需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目、进行对比得出结,金版,P21,实验设计,原则,(1),设立重复组：,统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布三个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。,(2),设立两种对照组：,栏目链接,四,.,结果分析与评价,2,2,分解纤维素的微生物的分离,2.,纤维素酶,纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即,C,1,酶,(,外切酶,),、,C,X,酶,(,内切酶,),和,葡萄糖苷酶,，前两种酶使纤维素分解成,纤维二糖,，第三种酶将,纤维二糖,分解成,葡萄糖,。,纤维二糖,C,1,酶、,Cx,酶,葡萄糖苷酶,葡萄糖,纤维素,3.,纤维素的分解：,土壤中某些微生物,(,真菌、放线菌及细菌,)能够产生,纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用,。,(,三,),、实验设计,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别培养基,挑选菌落,什么样的环境取样,?,培养的目的?,选择培养基的特点?,挑选什么样的菌落,?,鉴别培养基的特点?,如何鉴别?,根据,：微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；,目的：,增加纤维素分解菌的浓度，,以确保能够从样品中分离到所需要的微生物；,刚果红染色法,【,资料三,】,刚果红染色法,方法一：,先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应,方法二：,在倒平板时就加入刚果红,漂洗作用,氯化钠可以使结合不牢的刚果红洗去,这样就留下大大小小的透明圈,大的透明圈当然分解纤维素的能就强。,方法一中,NaCl,溶液的作用？,染色法,优点,缺点,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐,刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便,不存在菌落混杂问题,产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，,有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,思考：这两种方法各有哪些优点与不足,方法一：,先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应,方法二：,在倒平板时就加入刚果红,比较项目,分解尿素的细菌,纤维素分解菌,选,择,培养,基,原理,培养基类型,目的,鉴,定,培养基,原理,现象,方法,将细菌涂布在只有,尿素做氮源的选择,培养基上,将细菌涂布在只有,纤维素粉做碳源的,选择培养基上,固体培养基液体培养基,筛选菌株,选择培养,浓缩所需微生物,比较,项目,分解尿素的细菌,纤维素分解菌,选,择,培养,原理,培养基类型,目的,鉴,定,培养基,原理,现象,方法,在细菌分解尿素的化学反应,中，细菌合成的脲酶将尿素,分解成了氨，氨会使培养基,的碱性增强，,pH,升高。在培,养基中加入酚红指示剂，如,果,pH,升高指示剂会变红,刚果红可以与纤维素形成,红色复合物，当纤维素被,纤维素酶催化分解后红色,复合物无法形成，培养基,上就会出现以纤维素分解,菌为中心的透明圈,观察菌落周围是否有着色的,环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现,透明圈来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,酚红培养基,刚果红染色法,可根据是否产生,透明圈,来筛选纤维素分解菌,透明圈大的，,分解纤维素,的能力就强啦,刚果红染色法,