荧光分光光度法.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章荧光分光光度法,优选第八章荧光分光光度法,8-1,概述,一、分子发光分析法及其分类,某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法,较高激发态,基 态,吸收能量受激,光辐射退激,分子在退激过程中以光辐射形式释放能量,根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：,光致发光：以光源来激发而发光,电致发光：以电能来激发而发光,原子发射光谱法,生物发光：以生物体释放的能量激发而发光,化学发光：以化学反应能激发而发光,-,化学发光分析法,荧光,荧光分析法,磷光,磷光分析法,二、分子荧光分析法的特点,1.,灵敏度高,荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，可提高荧光强度,采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法低,24,个数量级,激发,发射荧光,强,强,激发光 物 质,2.,选择性好,不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长,不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长,比较容易排除其它物质的干扰，选择性好,3.,实验方法简单,4.,待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广,具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。,荧光法比磷光法应用广泛。,8-2,荧光和磷光光谱法,一、荧光和磷光光谱的产生,具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁产生荧光和磷光,基态分子 价电子跃迁到激发态,光照激发,去激发光,*,*,n,基 态,1.,电子自旋状态的多重性,大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方向总是相反的,，处于基态单重态。用,“,S,0,”,表示,；当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，,由基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，,净自旋,=0,.,这种跃迁是符合光谱定律的。,基态单重态,S,0,第一激发单重态,S,1,S,0,S,1,S,2,S,3,分别代表基态,第一,二,三激发单重态,单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为,10,-8,若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态单重态激发三重态，净自旋,0,。这种跃迁为禁阻跃迁,T,1,、,T,2,、,T,3,分别表示第一、二、三激发三重态,基态单重态,S,0,第一激发三重态,T,1,自旋平行,三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为,10,-4,1S,分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回到较低激发态或基态时有两种方式：无辐射去激和辐射去激,2.,无辐射去激,不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热的形式释放。包括：,内部转换（,IC,）,相同的多重态之间的转换,S-S,系间窜跃（,ISC,）,不同的多重态之间的转换,S-T,振动驰豫（,VR,）,同一电子能级中，从较高振动能级到较低振动能级的过程,外部转移,指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消灭,发生系间窜跃电子需转向，,S,1,T,1,间进行，比内部转换困难,T,1,S,0,ISC,VR,VR,IC,吸光 吸光,S,0,S,1,S,2,VR,：振动驰豫,IC,：内部转换,ISC,：系间窜跃,大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。,标准液 If s=KCs,由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云与苯环上的 轨道平行，共享了共轭 电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强,荧光分析仪器主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成,芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。,11 205 278,荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管,为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定,用“S0”表示 ；,定量分析依据 If=KC Ip=KC,温度对磷光影响更大,一、荧光和磷光光谱的产生,发生系间窜跃电子需转向，S1T1间进行，比内部转换困难,内部转换（IC）相同的多重态之间的转换 S-S,若荧光物质 M 与猝灭剂 Q 生成不发荧光的基态配合物MQ,3.,荧光和磷光光谱的产生,辐射去激,处于,S,1,或,T,1,态的电子返回,S,0,态时，伴随有发光现象，这种过程叫辐射去激,S,1,或,T,1,S,0,发光,（,1,）荧光：,当电子从第一激发单重态,S,1,的最低振动能级回到基态,S,0,各振动能级所产生的光辐射叫荧光,荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快，,10,-9,10,-6,s,，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭,无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量后到,S,1,的最低振动能级，发射荧光，荧光波长比激发光波长长。,荧,激,T,1,S,0,ISC,VR,VR,IC,吸光 吸光 荧光,图,5-1,分子荧光光谱产生过程示意图,S,0,S,1,S,2,VR,：振动驰豫,IC,：内部转换,ISC,：系间窜跃,（,2,）磷光,当,受激电子降到,S,1,的最低振动能级后，未发射荧光，而是经过系间窜跃到,T,1,振动能级，经振动驰豫到,T,1,最低振动能级，从,T,1,最低振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光,从,T,1,S,1,要改变电子自旋，发光速度慢，约为,10,-4,10s,，光照停止后，磷光仍可持续一段时间,分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长,磷,荧,激,*易产生荧光,n *,易产生磷光,T,1,S,0,ISC,VR,VR,IC,吸光 吸光 荧光 磷光,图,5-1,分子荧光、磷光光谱产生过程示意图,S,0,S,1,S,2,VR,：振动驰豫,IC,：内部转换,ISC,：系间窜跃,VR,二、荧光、磷光与分子结构的关系,了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产生荧光，在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么特征以便更好地运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光体变成强荧光体,（一）荧光效率,荧光强度常用荧光量子效率,f,来描述,荧光量子效率,f,=,发荧光的分子数,激发态分子总数,f,是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射荧光的能力，,f,越大荧光越强，在,01,之间,若以各种跃迁速率常数来表示,K,f,为荧光发射过程的速率常数,取决于物质的化学结构,K,i,为非辐射跃迁的速率常数之和,主要取决于化学环境，也与化学结构有关,分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率在,0.11,之间,至今对激发态分子的性质了解不深，无法定量地描述荧光与分子结构之间的关系,一般情况，有机芳香族化合物及金属离子配合物是最强最有用的荧光体,（二）荧光磷光与有机化合物结构的关系,物质只有吸收了紫外可见光，产生,*,n *,跃迁，产生荧光,*与,n *,跃迁相比，摩尔吸收系数大,10,2,10,3,，寿命短,*跃迁常产生较强的荧光，,n *,跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光,1.,共轭体系,有较强的荧光,具有共轭体系的芳环或杂环化合物，,电子共轭程度越大，越易产生荧光,;,环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强,f,ex,/nm,em,/nm,0.11 205 278,0.29 286 310,0.46 365 400,苯,萘,蒽,350,菲,线状环结构比非线状结构的荧光波长长,芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光,多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定,3,，,4-,苯并,芘是强致癌物,ex,=386 nm,em,=430 nm,2.,刚性平面结构,较稳定的平面结构,具有强荧光的分子多数有刚性平面结构,荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧光物质,酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，为非荧光物质,例,1,，,2-,二苯乙烯,反式：平面构型,强荧光体,顺式：非平面构型,非荧光体,（三）金属螯合物的荧光,大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定,不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与,M,n+,形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光,例：,8-,羟基喹啉为弱荧光体，与,M,n+,Al,3+,、,Mg,2+,形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强,（四）取代基的类型,取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类：,（,1,）增强荧光的取代基,有,-OH,、,-OR,、,-NH,2,、,-NHR,、,-NR,2,等给电子基团,由于基团的,n,电子（孤对电子）的电子云与苯环上的,轨道平行，共享了共轭 电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强,（,2,）减弱荧光的取代基,-COOH,、,-NO,2,、,-COOR,、,-NO,、,-SH,吸电子基团,使荧光波长短移，荧光强度减弱,芳环上被,F,、,Cl,、,Br,、,I,取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。,（,3,）影响不明显的取代基,-NH,3,+,、,-R,、,-SO,3,H,等,三、环境对荧光的影响,1.,溶剂的影响,同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质,一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大,2.,温度的影响,低温下测定，提高灵敏度,因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。,温度对磷光影响更大,3.pH,的影响,大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液,pH,的影响很大,共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长,例：苯酚,离子化后，荧光消失,pH1,有荧光,pH13,无荧光,但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光,例：,苯酚,有荧光,无荧光,另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性,四、荧光强度与荧光物质浓度的关系,用强度为,I,0,的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度,I,f,用仪器测得，在荧光浓度很稀,(A,0.05,),时，荧光物质发射的荧光强度,I,f,与浓度有下面的关系,I,f,=,f,I,a,=,f,（,I,0,-I,）,I,a,为吸收的辐射强度,I,0,为入射光强度,荧光池,I,0,I,I,f,荧光强度,检测器,I,f,=,f,（,I,0,-I,0,10,-A,）,=,f,I,0,（,1,-10,-A,）,I=,I,0,10,-A,将上式展开,当,A0.05,时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化,I,f,=2.3,f,I,0,A,=2.3,f,I,0,bc,当,A0.05,时，,I,f,与,f,、,I,0,、,和,c,有关，对一给定物质，当激发光波长和强度一定时，,f,、,I,0,、,和,b,为常数，合并为,K,I,f,=KC,I,p,=KC,定量分析依据,同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质,芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光,检测器与激发光互成直角,(1)如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定,吸光 吸光 荧光 磷光,不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长,Ki 为非辐射跃迁的速率常数之和主要取决于化学环境，也与化学结构有关,图5-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图,电子自旋状态的多重性,不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与Mn+形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光,If=KC,分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长,一、荧光和磷光光谱的产生,ex=386 nm,采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法低24个数量级,荧光强度与物质浓度呈线形关系，,I,f,=KC,只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高,浓度高时，,I,f,与C,不呈线形关系，有时,C,增大，,I,f,反而降低因为公式,中后面影响，有时发生荧光猝灭效应,荧光猝灭,荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降,或荧光效率,f,下降称为荧光猝灭。,使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂,氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂,碰撞猝灭,M+,激,M*,M*+Q M+Q+,热,自熄灭,荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象,荧光分析仪器,主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成,光源,第一单色器,液池,检测器,第二单色器,检测器,放大器及记录器,ex,em,与分光光度计有两点不同,两个单色器,检测器与激发光互成直角,I,0,I,五、荧光分析仪器,1,、光源,激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽,荧光计中，常使用卤钨灯作光源,荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯,利用汞蒸气放电发光的,光源；常用其发射,365 nm,、,405 nm,、,436 nm,三条谱线,以,365 nm,的谱线最强,应用最广泛的一种光,源，可发射,250800nm,很强的连续光源,2,、单色器,荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱,大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱,第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长,ex,，用此激发光激发液池内的荧光物质,ex,第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长,em,。在选定的,em,下测定荧光强度，定量分析,3,、样品池,盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边,4,、检测器,把光信号转化成电信号,放大,直接转成荧光强度,荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管,荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可 大大提高荧光强度,5,、读出装置,记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱,(2)如果两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱有显著区别,在某一激发光下一个组分产生荧光峰,另一组分不产生荧光;,荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，可提高荧光强度,(1)如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定,不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长,S0,S1,S2,S3分别代表基态,第一,二,三激发单重态,以365 nm 的谱线最强,当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋=0.,Ip=KC,发生系间窜跃电子需转向，S1T1间进行，比内部转换困难,ex=386 nm,荧光分析仪器主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成,荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧光物质,化学发光：以化学反应能激发而发光-化学发光分析法,多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定,（二）激发光谱和荧光、磷光光谱,荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定,激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱,I,ex,固定,em,荧光波长,获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的,em,不变，改变第一单色器波长，从,200700 nm,扫描，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以,I,为纵坐标，,ex,为横坐标得左图，即荧光物质的激发光谱,从曲线上找出,ex,，实际上选波长较长的高波长峰,I,em,固定,ex,激发光波长,获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的,ex,不变，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以,I,为纵坐标，,em,为横坐标得左图，即荧光物质的发射光谱,从曲线上找出最大的,em,从图中看出,磷,荧,激,图,吸收峰,荧光峰,磷光峰,六、,荧光分析及应用,（一）定量分析方法,定量分析依据,I,f,=KC I,p,=KC,1.,标准曲线法,最常用的定量分析方法,将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，配制一系列标准液，测定它们的相对发光强度。,以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标,浓度,C,1,C,2,C,3,C,4,C,5,Cx,荧光强度,I,f1,I,f2,I,f3,I,f4,I,f5,I,f,x,I,f,I,f,x,Cx,C,2.,荧光猝灭法,把荧光猝灭用在定量分析上，具有较高的灵敏度和选择性,若荧光物质,M,与猝灭剂,Q,生成不发荧光的基态配合物,MQ,M+Q=MQ,（非荧光物质）,经推导得出：,猝灭剂加入前,的荧光强度,猝灭剂加入后试,液的荧光强度,常数,猝灭剂浓度,I,前,/I,后,与,C,（,Q,）有线性关系，可求猝灭剂含量,与标准曲线法相似，对一定浓度的荧光体系，分别加入一系列不同量的猝灭剂,Q,，配成一个荧光物质,猝灭剂体系，然后在相同条件下测定它们的荧光强度，得一曲线,取相同荧光物质,C,M,C,M,C,M,C,M,C,M,加不同量,Q C,Q0,C,Q1,C,Q2,C,Q3,C,Qx,(C,Q0,=0),测,I,f,I,前,I,后,1,I,后,2,I,后,3,I,后,x,计算,I,前,/I,后,I,前,/I,后,1,I,前,/I,后,2,I,前,/I,后,3,I,前,/I,后,x,I,前,/I,后,x,C,Qx,C,Q,I,前,/I,后,3.,比较法,比较简单,如果试样数量不多，可用比较法进行测量,配一标准溶液浓度为,Cs,，,Cs,与未知液浓度,Cx,相近，并在相同条件下测定它们的荧光强度,未知液,I,f,x,=KCx,标准液,I,f,s,=KCs,比较,4.,多组分混合物的荧光分析,(1),如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定,可分别在各自的,荧,波长处测定,求出它们的含量,(2),如果两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱有显著区别,在某一激发光下一个组分产生荧光峰,另一组分不产生荧光,;,可选用不同的激发光进行测定,Al,3+,8-,羟基喹啉配合物的氯仿溶液,ex,=365nm,em,=520nm,Ga,3+,8-,羟基喹啉配合物的氯仿溶液,ex,=436nm,em,=520nm,365nm,激发光，,Al,3+,的配合物产生荧光，而,Ga,3+,配合物不产生荧光，无荧光峰；,436nm,激发光，,Ga,3的配合物产生荧光，而,Al,3+,配合物不产生荧光，无荧光峰,在,365nm,条件下激发，,520nm,处测,Al,3+,8-,羟基喹啉配合物，在,436nm,条件下激发，,520nm,处测,Ga,3+,8-,羟基喹啉配合物,例：,（二）荧光分析法的应用,荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点,1.,无机化合物的分析,无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定的为数不多，但与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，进行荧光分析的元素达,70,多种，其中较常采用荧光法测定的元素有：,Be,、,Al,、,B,、,Ga,、,Se,、,Mg,、,Zn,、,Cd,及某些稀土元素,能够同金属离子形成荧光配合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物，形成五元环或六元环的螯合物，分子的刚性平面结构增大，变为强荧光体,荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法。可采用荧光猝灭法间接测定的离子有：,F,-,、,S,2-,、,Co,2+,、,Ni,2+,、,Cu,2+,等,2.,有机化合物的分析,脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析,芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃,荧光分析法是最主要的测定方法,2,有机化合物的分析,为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定,可测定结构复杂的大量有机物质，如：各种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等,