生防微生物 第四节_内生细菌_92页.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第四节 内生细菌,一、概述,1,定义,内生细菌由克洛珀（,Kloepper,）第一次提出了“植物内生菌”的概念。早在,1926,年，,Perotti,等人在许多健康植物根组织内发现了细菌，被确定为植物体内存在细菌的起始点。,植物内生菌,（,Endophyte,）,是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌。,2,内生菌种类：,内生真菌（,Endophytic,fungi,）,内生细菌（,Endophytic,bacteria,）,内生放线菌（,Endophyticactinomyces,）等。,100,多年前人们就已发现在健康植物组织的内部也有微生物存在，这类微生物在文献中后来被称为植物内生菌。,自,20,世纪,30,年代发现造成畜牧业重大损失的牲畜中毒是由于食用感染内生菌的牧草后，内生菌的研究才得以广泛地开展起来。,我国于,20,世纪,70,年代陈延熙等相继在棉花、水稻、番茄、辣椒、花生、小麦、烟草、马铃薯、黄瓜等十多种作物中发现内生细菌。,近年来，随着研究领域的不断拓宽和研究方法的不断深入，植物内生菌所发挥的重要的生态和生理作用及其作为潜在生防资源和外源基因载体，在农业和医药领域中的巨大应用潜力，已逐渐成为国内外研究的热点。,黄瓜内生菌分离菌株对苹果腐烂病菌的抑制效果,分离菌株对棉花枯萎病菌的抑制效果,小麦内生菌,菌株对小麦全蚀病菌的抑制作用,菌株的革兰氏染色情况（,G,-,）,植物内生细菌普遍存在于高等植物中，木本、草本植物，单子叶植物和双子叶植物内均有内生细菌。,已在水稻、小麦、玉米、马铃薯、花生、甜菜、黄瓜、番茄、棉花、三叶草、柠檬、葡萄等,30,多种植物的不同器官中分离到了个,80,属的内生细菌。,内生细菌以假单胞菌属,（,Pesudomonas,）、,芽孢杆菌属,（,Bacillus,）、,肠杆菌属,（,Enterobacter,）,和土壤杆菌属,（,Agrobacterium,）,为主。,马铃薯内生细菌包括假单孢菌属,（,Pesudomonas,），,芽孢菌属,（,Bacillus,），,黄单孢菌属,（,Xanthomonas,），,黄杆菌属,（,Flavobacterium,），,棒杆菌属,（,Corynebacterium,），,不动杆菌属,（,Acinetobacter,），,气杆菌属,（,Aerobacter,），,微球菌属,（,Micrococcus,），,农杆菌属,（,Agrobacterium,）,等。,从花生中分离的内生菌有细菌和真菌。,内生细菌以巨大芽孢杆菌（,B.megaterium,）、,蜡样芽孢杆菌（,B.cereus,）,和枯草芽孢杆菌（,B.subtilis,），,还有黄单胞菌,(,Xanthomonas,spp.),和欧文氏菌,(,Erwinia,spp.),。,内生真菌以丛梗孢属,(,Monilia,),、,链格孢属,(,Alternaria,),和黑乌霉属（,Memmoniella,）、,曲霉菌（,Aspergillus,flavus,）,为主，未分离到放线菌。,3,作用,内生细菌在植物体内具有稳定的生存空间，不易受环境条件的影响，可以在植物体内独立的分裂繁殖和传递，使之成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌而加以利用。,A.,植物保护剂。,与根围、叶围细菌相比，内生细菌作为生防制剂具有二者不可替代的优势，如系统分布于植物体内、所处环境比较稳定、营养来源可靠且丰富等，从而更有利于其发挥作用。,B.,促生作用。,同根际促生细菌一样，内生细菌既可以产生促生物质，直接促进植物生长，也可以通过与病原菌竞争空间或产生拮抗物质从而间接起促生作用，因此内生菌完全有可能作为增产菌用于生产实践。,C.,内生细菌可起固氮作用。,D.,外源基因载体。,植物内生细菌是一种良好的外源基因载体，通过基因工程技术将,Bt,杀菌或杀虫基因导入内生菌中，构建成抗菌或抗虫的工程菌，用于生物防治。目前将,Bt,杀虫基因导入一些优良的内生菌，用于害虫的生物防治。,内生菌控制植物病害的机理,1.,产生抗生素类物质,内生菌产生的抗生素类物质存在植物体内，在植物体内转运，利于发挥防病作用。,根际内生菌产生的抗生素物质包括,2,4-,二乙酞藤黄酚,(PHL),、吩嗪羧酸,(PCA),、藤黄绿脓菌,(,pyoluterin,PLT),、硝吡咯菌素,(pyrrolnitrin,PRN),、脓青素,(PYO),、,HCN,和一类丁酰内酯,(butyrolactones),。其中，,PHL,和,PCA,的研究最为深入，它们对小麦全蚀病菌有较强的抑制作用，对黄瓜枯萎病也有一定的生防作用。香港城市大学,Urijmoed,教授等从中国南海红树中分离出来的内生真菌能产生灰黄霉素,A,和多种醌类抗生素，对酵母菌和霉菌等均有抑制作用。,2.,产生水解酶,植物内生真菌和内生细菌另一个重要的生防机制是产生水解酶类，如几丁质酶和葡聚糖酶。这些水解酶与植物抗真菌能力有密切关系，因为真菌细胞壁的主要组成成份是几丁质和葡聚糖。这些水解酶可以降解真菌的细胞壁或其它致病因子如毒素等，达到防病效果。一种用于防治水稻稻瘟病的内生细菌,Pseudomonas fluorescens,产生的几丁质酶和葡聚糖酶的水平与它的防病效果有密切的关系。某些生防菌的几丁质酶基因己经被克隆，可以将这些基因转化到内生菌中,发挥内生菌的优势，提高防病效果。一种用于防治棉花黄萎病的内生菌，可产生某些蛋白酶降解毒素达到防病的效果。,3.,产生植物生长调节剂,内生菌也可产生植物生长激素类物质，如,IAA,、吲哚乙腈等。,Lu,等,72,发现大多数黄花蒿内生真菌在体外培养时能产生对小麦和黄瓜幼苗生长不同程度的抑制或促进作用的代谢产物，对其中一种炭疽菌,(,Colletotrichum sp.,),发酵产物的深入分析表明，该菌能产生植物生长激素,IAA,。假单胞菌属、肠杆菌属、葡萄球菌属,(,Staphylococcus,),、固氮菌属,(,Azotobacter,),以及固氮螺菌属,(,Azospirillum,),内生细菌的一些菌株也可产生植物生长调节物质如乙烯、生长素、细胞激动素,对宿主植物的生长起促进作用。草生欧文氏菌,(,Erwinia herbicola,),不仅能产生吲哚乙酸，而且还能产生细胞分裂素这些物质都能有效地促进植物的生长。从墨西哥分离的,18,株重氮营养醋杆菌,(,Acetobacter dizotrophicus,),都有产生生长素的能力,74,。表明重氮营养醋杆菌在与植物相互作用过程中不仅能固氮，而且还可以通过生长素的调节作用影响植物的谢促进植物生长,75,。最近的一项研究表明，产酸克雷伯氏菌,(,Klebsiella oxytoca,),产生的生长素对水稻植株的生长和发育起着重要的调节作用。,4.,与病原菌竞争营养物质,内生菌可以与病原菌形成营养竞争的对抗关系，使病原菌因得不到正常的营养供给而消亡。某些根际定殖内生细菌能产生噬铁素与病菌竞争铁元素，而植物并不受其影响。荧光假单胞杆菌能产生一种黄绿色噬铁素与病菌竞争铁，导致病菌因得不到铁元素而死亡，但在铁充足的情况下，此种竞争引起的病害下降就不明显,77,。田新莉等,78,证明水稻内生真菌在平板颉抗试验中是通过竞争铁元素来抑制纹枯病菌的生长的。,5.,促进宿主植物生长或增强抵抗力,感染内生菌的植物一般具有比未感染内生菌的植株生长快速的特点。内生菌可增进宿主植物对,N,、,P,、,K,等营养元素的吸收。内生菌帮助植物吸收营养一个最典型的例子是内生固氮菌，,1988,年从甘蔗的根茎中分离到内生固氮营养醋杆菌,后来在其它作物中如玉米、高粱、水稻等分离到内生固氮菌草螺菌，从巴基斯坦生长在盐碱地的,Kallar,草中分离到固氮弧菌,(,Azoarcus sp,.),。人们在研究这些内生固氮菌时发现有些菌类能提供植物高达,80%,的氮量,79,。傅正擎等,80,用内生菌及其代谢产物与棉花黄萎病菌共培养的方式，证明内生菌可通过促生长作用来提高棉株的抗逆性。陈世苹等,81,证明，在正常条件下，感染内生真菌的黑麦草体内保护酶系统如,POD,、,SOD,的活性明显高于未感染内生真菌的植株，并认为内生真菌很可能增强了植物的,SOD,活性调节能力，从而对植物的抗旱性产生有益影响。许多研究表明，感染内生菌的植物比未感染内生菌的植物具有更强的抗干旱、盐碱等胁迫的能力。,6.,诱导植物产生抗性,对这个生物防治机制，,Van Loon82,和,Van Wees,等,83,叙述的较为清楚。他们认为根际微生物包括在根内定殖的微生物能诱导植物产生一种抗性，这种抗性不同于传统的系统获得性抗性,(systemic acquired resistance,SAR),，命名为诱导系统抗性,(induced systemic resistance,ISR),。,ISR,表型与病菌诱导的,SAR,相似，都能诱导植物产生对病菌的广谱抗性。但,ISR,中所包含的抗性机制没有病程相关蛋白,(PR),的产生。目前对,ISR,的抗性机制知道得不如,SAR,的抗性机制清楚，一般认为,ISR,的抗性与植保素水平的提高和酚类物质积累有关。,ISR,和,SAR,信号传导途径是两种不同的路径。同时内生菌能诱导植物产生一些结构方面的抗性，,Benhamou,等,84,用内生菌,Bacillus pumilus,strain SE34,预接种基因转化豌豆，然后接种病菌，如果病菌的生长限制在木栓层和外皮层内，在病菌企图侵入部位，通过木质和酚类物质的大量沉积，这些细胞的胞壁得到加厚，有效阻止了病菌的侵入。,7.,产生生物碱,植物内生真菌可以产生多种生物碱，大多生物碱对食草动物和昆虫具有毒性，其中一些对植物病害也有防治作用。,Li,等,85,从雷公藤,(,Tripterygium wilfordii,),中分离到一株内生真菌,(,Cyptosporiopsis cf.quercina,),，从其液体发酵产物中分离到一种新酰胺生物碱,(cryptocin),，对稻瘟病菌,(,Pyricularia oryzae,),有抑制作用。,Elmi,等,86,推测感染了内生真菌的高羊茅植株的抗线虫性与内生真菌产生的生物碱有关。,二、生态学,1,寄生方式,专性内生菌：,只能生活在寄主细胞内，而在根际无法分离到。如红苍白草螺菌只能生活在高梁和甘蔗组织内。,兼性内生细菌：,如假单胞菌属,（,Pesudomonas,）、,肠杆菌属,（,Enterobacter,）、,沙雷氏军属,（,Sarratia,）、,产碱菌属,（,Alcaligens,）、,志贺氏菌属,（S,higella,）、,檬细菌属,（,Citro,bacter,）,以及革兰氏阳性一些属的细菌，他们不仅生活在植物组织内部，而且也常见于土壤。,持久性：,持久性的植物内生的细菌可以永久存在于植物组织内部，也可以在整个生育期只存在一段时间。甜菜中的腐烂棒杆菌，存在于整个生活史中。,非持久性：,非持久性的细菌只存在于整个生活史中的部分生长时期的植物体内。大部分植物内生细菌属于这一类型。,专一性：,专一性的植物内生细菌它只专一存在于一种植物体内，如重氮营养醋杆菌（,Acetobacter,），,它只存在于甘蔗中。,非专一性：,非专一性的植物内生细菌，如荧光假单胞可以存在于菜豆、小麦、番茄、柠檬、甜菜和玉米等植物体内，均已经分离出来。,2.,入侵途径,植物内生细菌来源于根际，并从根进入植物组织内部。内生细菌进入植物的途径是通过自然孔口和伤口进入植物的。自然孔口有皮孔、水孔、芽眼、侧根发生处等。把组织培养的马铃薯无菌苗移栽到田间，从中分离出大量与土壤中细菌种类相同的内生细菌。利用抗菌素标记的荧光假单孢菌,IS-1,的菌悬液浸根，然后移栽，八周后，取根，进行表面消毒，结果重新分离到了,IS-1,。,这不仅说明了内生细菌来源于根际土壤，而且说明了一些细菌既能存在于根际中，又能进入植株体内。,植物内生细菌可以通过趋化性或趋电性寻找寄主植物。,3,存在部位,内生细菌进入植物后，多数定殖于薄壁组织的细胞间隙，有些定殖于细胞质中，有些可穿过细胞壁进入细胞内。有些定殖于维管束内。,块薯中菌量大，种类多；块茎和地上茎次之；种子中最少。块茎的皮层，维管束，内韧皮部和中央髓部四个部位中，内生细菌在维管束环的出现频率最高。,玉米和杂草的的皮层、外皮层和内皮层，以及植株木质部中都含有大量的内生细菌。内生细菌具有寄主专化性，且在寄主不同器官、生育期和寄主所处的环境中，其种群数量的消长动态各有不同。,内生细菌与植物在长期的共同进化中，已成为植物微生态系统的天然组成成份，它促进植物对恶劣环境的适应，加强系统的生态平衡。植物内生细菌可以促进植物修复作用（,phytoremediation,），,针对硝基芳香族、杂酚类等有机污染。,一些内生菌具有固氮作用。内生细菌系统地存在于细胞间隙和细胞内，可从植物体内获得充分的生长营养，具有优良的生存环境，能稳定分布于植物体内，因此将其作为病害的生防菌具有独特的优势。因此内生细菌作为生防因子已从多种植物中分离出来并用于病虫害的防治。,植物内生细菌的远距离传播主要通过种子传播，也可以通过昆虫和动物的取食途径传播。,4,种群数量动态,内生细菌在寄主植物中的种群数量变化与植物的品种、组织、生长阶段、和环境条件有关。,内生细菌在植物根部密度最高，其次是茎和叶。从种子萌发时含量开始上升，自花期达到最高，之后趋于平稳或降低。,棉花种子萌发时，细菌的种群密度为每克组织含,1000,个菌体，成株期达到,10,万,100,万个菌体。成熟期降到,1000,个菌体。棉桃中几乎没有内生菌。,从薯块最外面所分离的内生菌中拮抗菌的数量多、作用强，越向内部，拮抗菌的比例减小，作用变弱。随着种薯腐烂，其中内生细菌大量向根围释放，从而使根围的菌量显著增加，这必然会使更多的细菌进入植株体内。,5.,内生菌起源,三种假说：,（,1,）内生假说：,是由植物细胞内的线粒体或叶绿体演化而来的，因此，它们有与宿主有相同或相近的遗传背景。,（,2,）外生假说：,源于体外，一方面是植物体表，一方面是植物根系通过自然孔或伤口进入体内。,（,3,）病原菌演化假说：,病原菌在与植物长期的共同进化中，病原菌的毒性基因发上了变异，由毒性菌株变化为非毒性菌株。,三、防治机制,防治机理有三种。,1.,内生菌在病原菌侵染植物之前在植物体内抢先聚集占位。,主要发生在利用维管组织的内生菌拮抗侵染维管的病原菌如轮枝菌（,Verticillium,）,、,镰刀菌（,Fusarium,）、,青枯菌属（,Ralstonia,）,的过程中。,2.,产生抗生素直接拮抗病原菌,产生抗生素类物质是内生菌在体外进行生物控制的机理之一。马铃薯块茎内生菌中拮抗病原菌,Phytophthora,infestans,，,Fusarium,sambucinum,F.avenaceum,F.,oxysporum,的抗生素含量不同，从距离表皮越近部位分离到的内生菌抗生素含量越高。,从棉株内分离出的两株内生细菌及其代谢物对棉花黄萎病菌的菌丝生长及其毒素的产生均有抑制作用。,从水稻体内分离出的内生细菌对水稻纹枯病菌丝有抑制作用，对纹枯病菌菌核的萌发则有强烈的抑制作用。,烟草内生细菌抑制了烟草疫霉菌丝生长，游动孢子游动和萌发。,黄瓜的内生细菌可造成黄瓜枯萎病菌丝生长畸形，部分细胞空泡化。,3.,诱发系统抗性,诱发系统抗性是内生菌的主要生防机理。诱导抗性是植物被环境中的非生物或生物因子激活产生的系统抗性，分为两类即,获得性系统抗性（,SAR,）,和,诱发性系统抗性（,ISR,）,。,第,2,种和第,3,种机制是内生菌和病原菌在侵染位置如根的皮层直接作用时的生物防治机理。,SAR,是由病原微生物,二氧化硅（,SiO2,）、,磷酸盐等无机物质高不饱和脂肪酸等有机物和植物的物理性损伤引发。,SAR,的特征是宿主植物中水杨酸（,salycilic,acid),浓度增加接着植物细胞壁木质化生成植物体内病原相关蛋白,PR,。,在,SAR,的诱发过程中茉莉酸酮酯在第二信号传导系统中起信号分子的作用,ISR,主要是由非病原性微生物诱发不仅宿主植物组织内聚集的某类微生物可以引发,ISR,根部细菌产生的铁载体也可以引发,ISR,，,salycilic,acid,信号途径不参与该过程。,利用内生菌控制植物病害的途径,1.6.1,人工接种内生菌可以通过人工接种方法将有防病活性的内生菌接种到植物体内，发挥内生菌的防病作用。目前常用的人工接种内生细菌的方法有,3,种：灌根接种法，用内生菌悬浮液浇灌植株根际，这种方法可以使内生菌进入植物根茎内,101,。浸种接种法，在播种前将宿主植物的种子在含有内生菌悬浮液中浸泡一定时间，在生长出的植物体内可以检测到被标记的内生菌,102,。涂抹叶片接种法，何红等,103,采用这种方法可以将枯草芽孢杆菌,BS22,菌株接种到多种植物体内。常用的人工接种内生真菌的方法有茎基部注射、人工侵染和愈伤组织培养等方法。中国农业大学从棉株分离的一种内生真菌,(,Chaetomium sp.,),，经人工茎基部注射后有抑制萎蔫镰刀菌扩展的作用。用内生真菌人工侵染植物是对其利用的另一种有效手段。,Latch,和,Christensen,用,5,种内生真菌进行了人工侵染实验，发现在幼苗期侵染能够实现，而成熟植株的侵染没有成功,104,。,Johnson,等用愈伤组织培养的方法进行了侵染实验，发现有,17%,的再生植株被感染,105,。,1.6.2,利用内生菌分泌的抗生素,植物内生菌分泌的抗生素是抑制和杀死病原菌的直接作用物质，内生菌代谢产物的应用也受到了人们的注意。可以直接利用内生菌的代谢产物控制植物病害，内生菌产生的抗生素可以作为无公害农药的又一来源。根际内生菌,Pseudomonas spp,.,产生的一类鼠李糖脂生物表面活性剂,(rhamnolipid biosurfactants),物质，破坏腐霉菌,(,Pythium,),卵孢子的原生质膜，引起卵孢子细胞壁的水解破裂,106,。对小麦全蚀病有防效的,P.fluorescens,CHAO,能产生一些吩嗪类,(phenazine),物质。,Bacillus,strains,能产生一些脂多肽,(lipopeptide),类抗生素对植物根部病害有显著的抑制作用,106,。对多种植物病害有防治作用的,P.fluorescens,CHAO,能产生几种毒性代谢物质，包括,PCA,HCN,和,PLT,等,107,。,PCA,和,PHL,合成的相关基因簇己经被克隆，这就可以将两者的基因整合到同一个内生细菌中，大量地合成提高生物防治效果,108,。,1.6.3,作为外源基因的载体,内生菌是构建“工程菌”的理想载体。因内生菌具有在植物体内定殖、繁殖、转,移的特点，将某些抗病虫基因导入到内生菌中，能提高植物的抗病虫能力，而植物本身的基因并未发生改变，这样可以保持植物的天然性状。,Kostaka,发现从百慕大草,(,Cynodon dactylon,),中分离的木质棍状杆菌犬齿亚种,(,Clavbacter xyli subsp.cynodontis,),接种到某些植物上后可以很快转移到整个植物体中。利用这一特点将苏云金杆菌,(,bacillus thuringiensis,),的伴胞晶体编码基因转移到这种内生细菌中，实现了对欧洲玉米螟,(,Qstrinia.nubilalis,),的生物防治,109,，减少了化学农药的使用。将苏云金杆菌基因转入蜡状芽孢杆菌,(,B.cereus,),内，实现了对两种鳞翅目昆虫的防治,110,。,利用内生菌控制植物病害的途径,1.6.1,人工接种内生菌,可以通过人工接种方法将有防病活性的内生菌接种到植物体内，发挥内生菌的防病作用。目前常用的人工接种内生细菌的方法有,3,种：灌根接种法，用内生菌悬浮液浇灌植株根际，这种方法可以使内生菌进入植物根茎内,101,。浸种接种法，在播种前将宿主植物的种子在含有内生菌悬浮液中浸泡一定时间，在生长出的植物体内可以检测到被标记的内生菌,102,。涂抹叶片接种法，何红等,103,采用这种方法可以将枯草芽孢杆菌,BS22,菌株接种到多种植物体内。常用的人工接种内生真菌的方法有茎基部注射、人工侵染和愈伤组织培养等方法。中国农业大学从棉株分离的一种内生真菌,(,Chaetomium sp.,),，经人工茎基部注射后有抑制萎蔫镰刀菌扩展的作用。用内生真菌人工侵染植物是对其利用的另一种有效手段。,Latch,和,Christensen,用,5,种内生真菌进行了人工侵染实验，发现在幼苗期侵染能够实现，而成熟植株的侵染没有成功,104,。,Johnson,等用愈伤组织培养的方法进行了侵染实验，发现有,17%,的再生植株被感染,105,。,1.6.2,利用内生菌分泌的抗生素,植物内生菌分泌的抗生素是抑制和杀死病原菌的直接作用物质，内生菌代谢产物的应用也受到了人们的注意。可以直接利用内生菌的代谢产物控制植物病害，内生菌产生的抗生素可以作为无公害农药的又一来源。根际内生菌,Pseudomonas spp,.,产生的一类鼠李糖脂生物表面活性剂,(rhamnolipid biosurfactants),物质，破坏腐霉菌,(,Pythium,),卵孢子的原生质膜，引起卵孢子细胞壁的水解破裂,106,。对小麦全蚀病有防效的,P.fluorescens,CHAO,能产生一些吩嗪类,phenazine),物质。,Bacillus,strains,能产生一些脂多肽,(lipopeptide),类抗生素对植物根部病害有显著的抑制作用,106,。对多种植物病害有防治作用的,P.fluorescens,CHAO,能产生几种毒性代谢物质，包括,PCA,HCN,和,PLT,等,107,。,PCA,和,PHL,合成的相关基因簇己经被克隆，这就可以将两者的基因整合到同一个内生细菌中，大量地合成提高生物防治效果,108,。,1.6.3,作为外源基因的载体,内生菌是构建“工程菌”的理想载体。因内生菌具有在植物体内定殖、繁殖、转,移的特点，将某些抗病虫基因导入到内生菌中，能提高植物的抗病虫能力，而植物本身的基因并未发生改变，这样可以保持植物的天然性状。,Kostaka,发现从百慕大草,(,Cynodon dactylon,),中分离的木质棍状杆菌犬齿亚种,(,Clavbacter xyli subsp.cynodontis,),接种到某些植物上后可以很快转移到整个植物体中。利用这一特点将苏云金杆菌,(,bacillus thuringiensis,),的伴胞晶体编码基因转移到这种内生细菌中，实现了对欧洲玉米螟,(,Qstrinia.nubilalis,),的生物防治,109,，减少了化学农药的使用。将苏云金杆菌基因转入蜡状芽孢杆菌,(,B.cereus,),内，实现了对两种鳞翅目昆虫的防治,110,。,四、生防菌的分离方法,1.,内生菌的分离,（,1,）材料,采集不同地区、不同品种的苗期、开花期、,荚果膨大期的无病株和种子。,（,2,）分离用培养基,a,采用牛肉膏蛋白胨固体培养基分离细菌,b,采用,PDA,培养基分离真菌,c,采用高氏,1,号培养基分离放线菌,（,3,）分离方法,a.,取无病株或种子，先用水冲洗干净，然后在,0.1%,十二烷基苯磺酸钠中浸泡,30min,，,再用水冲洗干净，然后随机称取根、茎、叶各,5g,，,纱布包裹，以下工作在超净工作台上进行。,b.,包裹好的材料浸入,0.1%,的,HgCl2,中消毒,18min,，,再用无菌水冲洗,3,4,次。取,0.2ml,最后,1,次无菌水冲洗液涂布接种于,3,种分离培养基上，每个处理重复,3,次，培养,48h,，,观察有无菌落产生。据此验证此消毒方法是否能全部杀死供试材料表面微生物。,c.,然后供试材料转入无菌研钵中研磨匀浆，加入,5ml,生理盐水，搅匀。以此为母液，稀释,10,-1,、,10,-2,、,10,-3,、,10,-4,、,10,-5,5,个梯度菌悬液。然后分别取,0.2ml,加入,3,种分离培养基中进行内生菌的分离，每个处理重复,3,次。,分离方法及步骤,不同部分内生菌分离纯化,活性菌株,发酵液和菌丝体,提取物生物活性测,活性测定,活性最高的菌株,菌株鉴定,活性成分分离,活性成分鉴定2.,表面消毒效果的常用检验方法,有两种,(1),漂洗液检验法，,即把最后一次漂洗灭菌材料的漂洗液吸,取,0.2,0.3ml,涂布于固体平板上。,(2),组织印迹法，,即把经灭菌、无菌水漂洗过的材料置于,固体平板上保留几分钟，然后移去样品。于,28,培养,48,小时，检查表面消毒是否彻底。,3.,纯化与鉴定,按常规方法对分离出的菌落进行纯化，以供鉴定和保藏。对细菌和真菌一般要鉴定到属，常见属鉴定到种。,1.,小麦内生细菌,菌株对小麦全蚀病菌的抑制作用,菌株的革兰氏染色情况（,G,-,）,2.,黄瓜内生菌,病菌的抑制效果,分离菌株对苹果腐烂,分离菌株对棉花枯萎,病菌的抑制效果,菌株产,-1,3葡聚糖酶的皿内情况,菌株对油菜菌核病菌的抑制效果,第五节 内生放线菌,一、内生放线菌,植物内生放线菌有：,根部结瘤的弗兰克氏菌（,Frankia,）,一个放线菌新属（,Actinosynemma,）。,玉米根叶中分离出放线菌主要为：,小双孢菌,链霉菌,链孢囊菌。,链霉菌最多,(n=482),，,链轮丝菌,(n=2),诺卡氏菌,(n=4),小单孢菌,(n=1),链孢囊,(n=1),。,二、分离方法,.,组织表面消毒,消毒剂：,次氯酸钠,环氧丙烷气,过氧乙酸,升汞,硝酸银等,大多数的内生菌分离采用升汞或次氯酸钠，但是不同文献中使用的浓度和处理的时间不同。目前的内生菌分离方法没有考虑专性内生菌以及处于休眠状态的内生菌。因此，都有一定的局限性。,培养基,使用不同的培养基和在培养基中添加不同的抗生素来实现，这些选择剂的添加是必要的。因为内生真菌的生长一般比内生放线菌快，容易在分离培养皿中过量生长。,选择性培养基：,主要是以淀粉为碳源，酪蛋白为氮源，加以制霉菌素、放线菌酮等抗真菌化合物以促进放线菌的生长，但是多数研究是为了了解内生放线菌的群落生态组成，因此只选用一种或几种分离培养基。,干热等用于提高土壤中放线菌分离数量，预处理方法也可以用于植物组织。,分离困难的主要原因,弗兰克氏分离困难主要原因在于：,（,1,）一般离体培养需要,2,3,周或更长时间,（,2,）土壤中含有快生型的微生物如细菌腐生放线菌或真菌等弗兰克氏菌生长缓慢很难获得纯种,（,3,）内生菌作为共生菌离体培养后菌体由共生代谢型转变为腐生代谢型因此营养条件需求很苛刻,（,4,）在离体培养过程中植物组织释放出抑制菌体生长的多酚化合物使弗兰克氏菌在体外培养过程中难以生长。,第六节 内生真菌,一、概述,1993,年,，,美国化学家,Stierle,和植物病理学家,Strobel,从短叶红豆杉,（,Taxus,brevifolia,）,的韧皮部分离到一株产紫杉醇的内生真菌,（,Taxomyces,andreanae,）,。通过采用质谱、色谱和放射性化学标记等方法,证明分离到的真菌的,3,周培养物中存在紫杉醇及其类似物，含量为24-50 ng/L,。,随,后，,我国,陆续从多种红豆衫属植物（,Taxus,spp,）中分离到许多产紫杉醇的内生真菌，对解决紫杉醇严重紧缺开辟了一条新路。,自此，人们开始关注内生真菌的次生代谢产物及其生物活性。,1.,内生真菌主要种类,:,一类是,麦角菌科：,系统侵染性草生内生菌，多与寄主形成互惠共生；,另一类,非麦角菌科：,树木、灌木及草本植物上的内生菌。,相对内生细菌来说,植物内生真菌的研究尚缺乏一定的系统性。,大多数植物内生真菌属于子囊菌类（,Ascomycetes,）,包括,核菌纲（,Pyrenomyetes,）,盘菌纲（,Discomyetes,）,腔菌纲（,Loculoascomyetes,）,的许多种类以及它们的一些衍生菌。,禾草类内生真菌与其它无处不在的内生真菌的区别，在于它们和寄主植物形成了非常密切的关系，至今全世界至少在调查过的,80,个属,290,多种的禾草中发现有与之共生的内生真菌。,2.,内生真菌存在部位：,宿主植物的叶鞘和种子中含量最多，而叶片和根中含量极少。,不同组织内生真菌的数量存在差异。老叶的组织分离率为,34,，新叶组织分离率为,20,，老树皮为,25,，根和果实的组织分离率最低，分别为,16,和,14,。,3.,内生真菌的生物活性代谢产物：,生物碱、萜类、甾体等化合物，在抗癌症药物、抗肿瘤类药物、抗生素类药物等，且取得了令人振奋的成绩。,1,生物碱类,植物内生真菌产生的生理活性物质中，生物碱是最重要的一类。,以香柱菌属（,Epichloe,）（,其无性型为,Neotyphodium,属）内生真菌研究得较多，如从高羊矛、黑麦草和其它禾本科植物的茎叶中分离到的内生真菌,Neotyphodium,coenophialum,、,N.,lolli,，,Epichloe,festucae,和,E.,typhina,，,对其进行发酵培养，从发酵液中分离到,Peramine,，,它具有杀虫活性，但对哺乳动物无毒性。,此外，在,Neotyphodium,属内生真菌发酵液中发现一些麦角生物碱类化合物，这类化合物对昆虫和食草哺乳动物具有神经毒性，如Ergovaline,，,它与家畜食用内生真菌侵染的高羊矛中毒有关。,细胞生长素吲哚乙酸（,IAA,）,属于吲哚类生物碱，具有促进植物生长的作用，在烟草中分离出来的内生真菌麻饼炭团菌（,Hypoxylon,serpens,）,发酵液中发现了这种化合物。,6-Isoprenylindole-3-carboxylic acid,是一种新发现的吲哚类生物碱，它对革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌（,Bacillus,subtilis,）、,金黄色葡萄球菌（,Staphylococcus,aureus,）、,藤黄八叠球菌（,Sarcina,lutea,）,和革兰氏阴性细菌假单胞菌（,Pseudomonas,sp.,）,均具有抑制作用。此外，该化合物对一些植物病原真菌辣椒疫霉（,Phytophthora,capisici,）、,禾谷丝核菌（,Rhizoctonia,cerealis,）,和禾顶囊壳小麦变种（,Gaeumannomyces,graminis,var.,tritici,）,有抑制活性。,在苇状羊茅（,Festuca,arundinacea,）,的内生真菌,N.coenophialum,中发现黑麦草碱（,Loline,），,它属于吡咯烷生物碱类化合物，是一种广谱的杀虫剂。,从香港红树（,Avicennia,marina,）,种子中分离出的内生真菌,2524,号，其发酵液中分离到两个神经酰胺：,(2,，,3-,dihydroxytetracosanolyamino,)-1,，,3-,dihydroxy,-,octadecane,(,4,),和,(2,，,3-dihydroxydocosanoylamino)-1,，,3-,dihydroxy,-,octadecane,，,它们是细胞内重要的第二信使化合物。,从苏格兰松树（,Pinus,sylvestris,L.,）,的茎尖组织中分离到内生真菌,Rhodotorula,minuta,，,它可以产生一种腺嘌呤衍生物，这种衍生物是植物细胞分裂素生物合成的前体，具有恢复愈伤组织生长并防治褐化的作用。,长春花（,Catharanthus,roseus,）,内生真菌,CY3,代谢产生长春新碱（,Vicristine,），,长春新碱是一种有效的抗肿瘤药物。从美登木（,Maytenus,hookeri,）,中分离筛选到一株球毛壳菌（,Chaetomium,globosum,），,它可以产生抗癌化合物球毛壳甲素（,Chaetoglobosin,A,）。,2,萜类,内生真菌代谢产物中萜类化合物较多。,主要包括倍半萜和二萜两种。,在短叶紫杉（,Taxus,brevifolia,）,内生真菌,Pestalotiopsis,spp.,发酵液中发现五种倍半萜类代谢产物，其中,17,是第一个来源于真菌的具有生物活性的葎草烷衍生物。,从叶点霉属（,Phyllosticta,sp.,）,内生真菌中分离得到的,Heptelidic,acid,和,Hydroheptelidic,acid,是倍半萜类化合物，它们对云杉蚜虫幼虫具有毒性。,雷公藤（,Tripterygium,wilfordii,）,中内生真菌串珠镰孢胶孢变种（,Fusarium,moniliforme,var.,subglutinans,）,代谢物中存在,Subglutinol,A,和,Subglutinol,B,两种二萜类化合物，它们具有免疫抑制作用，且没有细胞毒性。,3,甾体类,黄花蒿（,Artemisia,annua,）,内生真菌炭疽菌（,Colletotrichum,sp的液体培养基中发现,3-Hydroxyergosta-5,ene,、,3-,Oxoergosta,-4,，,6,，,8,，,22-,tetraene,、,3,，,5-,Dihydroxy,-6-,acetoxyergosta,-7,，,22-,diene,和,3,，,5-,Dihydroxy,-6-phenyl-,caetoxyergosta,-7,，,22-,diend,四种甾体化合物，它们对植物病原菌禾顶囊壳小麦变种（,Gaeumannomyces,graminis,var.,tritici,）、,禾谷丝核菌（,Rhizoctonia,cerealis,）、,麦根腐长蠕孢菌（,Helminthosporium,sativum,）,和辣椒疫霉（,Phytophthora,capisici,）,表现出抗菌活性,.,4,其它活性物质,内生真菌代谢产物种类较多，其他活性物质还包括醌类、环肽、脂肪酸类等。,Rugulosin,是一类具有杀虫活性的苯醌类化合物，它是从冷杉（,Abies,balsamea,）,内生真菌,Hormonema,dematioides,中分离得到的。,白灰制菌素,A,（,Leucinostatin,A,）,是一个具有抗癌和抗菌活性的化合物，最初是从青霉菌（,Penicillium,sp,）,中分离得到的，在欧洲紫杉（,Taxus,baccata,）,的内生真菌,Acremonium,sp.,，,发酵液中也发现这种细胞毒素。,Echinocandins,A,、,B,、,D,和,H,是四种具有抗菌活性的内生真菌代谢产物，他们是从,Cryptosporiopsis,sp.,和,Pezicula,sp.,中发现的。,从栎树（,Quercus,sp.,）,的内生真菌,Cytonaema,sp.,中分离到两种新的异构体,Cytonic,acid A,和,Cytonic,acid B,，,它们可以作为人细胞肥大病毒蛋白酶抑制剂。,Cryptocandin,是内生真菌,Cryptosporiopsis,cf,.,quercina,的代谢产物，具有抗真菌的活性。从来自不同地方的植物中分离出,500,株内生真菌，其中,17,株发酵液提取物具有杀线虫活性，确定活性最强的成分为,3-,羟基丙酸（,3-Hydroxypropionic acid,）。,紫杉醇,(,Taxol,),：,一种头孢菌素类抗癌药物，它发现于植物的树皮中，其含量非常之小，远远不能满足人们的需求。,植物内生菌次生代谢产物的多样性为人类突破植物资源周期长、产量低、不可再生等限制，利用植物内生菌工业发酵生产重要的药物开辟了新途径，具有极大的应用价值和开发潜力,。,植物内生真菌是应用前景非常广阔微生物的资源：,80%,的植物内生真菌对细菌，真菌，藻类，杂草等其中一种或多种有作用；而土壤中分离