FDNB法测定氨基酸含量_吉林大学_23页.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,JILIN UNIVERSITY,RESEARCH,CENTER FOR DRUG METABOLISM,FDNB,法测定氨基酸含量,主讲教师:王英武,电,话:5619955,电子信箱:,wyw,jlu,.,edu,.,cn,实验目的,熟悉色谱仪器的组成及原理,了解色谱分离的原理.重点介绍反相色谱柱(以,C18,为例),定量分析的方法(外标法),梯度洗脱实验及氨基酸衍生化实验(,FDNB,法),色谱仪器的组成及原理,I,HPLC,组成,脱气系统(在线与离线),氦气脱气 真空脱气 超声脱气,流动相传输系统(色谱泵)一元 二元 三元 四元 多元,评价指标:压力限制,流速范围及精度 冲程大小等,进样系统(手动与自动进样器),评价指标:精度 重现性 死体积 速度 可控性(温度及各种其他功能),柱温箱,功能:维持流动相与固定相的温度恒定,评价指标:温度范围 升温或降温的速度 温度,维持的精度 死体积大小,检测系统,紫外 视差检测 质谱检测 电化学检测,荧光检测,DAD,检测 蒸发光色散检测等,数据采集系统,软件的可操作性,采集速率,文件存储能力,色谱仪器的组成及原理,II,色谱分离的原理,色谱分离的基本原理是不同化合物在色谱柱上的差速迁移导致的色谱分离,分离方式多种多样,min,0,0.5,1,1.5,22.5,3,mAU,0,20,40,60,80,1.939,分流对紫外检测的影响,黄色 0.5,mL,/min,白色 1.0,mL,/min,红色 2.0,mL,/min,min,0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,mAU,-20,0,20,40,60,80,100,120,140,Area:2028,High:142,7.65,3.91,1.94,Area:1021,High:110,Area:544,High:85,流速对保留时间及峰面积的影响,有机相比例对出峰时间和峰面积的影响,HPLC,条件的优化,洗脱方式,一般采取等梯度洗脱，这样分析速度快,但有时也会采取梯度洗脱如分析多肽类化合物一般采取梯度洗脱，此时的信号会比等梯度洗脱时强很多，而且可以加大进样量。是提高灵敏度的一种措施，但是分析时间较长。需要有平衡的时间。,0,500,1000,1500,2000,2500,3000,3500,4000,4500,0,1,2,3,4,5,6,time(min),peak height,梯度洗脱,HPLC,条件的优化,柱温对色谱行为的影响,依那普利,色谱柱,色谱柱的规格 填料 颗粒粒径孔径 厂商,流动相组成 洗脱方式 柱温,检测方式及具体条件,流动相的组成对分离度的影响,流速对色谱行为的影响,柱温对色谱行为的影响,溶剂对色谱的影响,pH,值 离子强度 缓冲液 离子对等其他因素的影响,定量分析的方法(外标法),0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.2,2.6,3.0,Time,min,0%,50%,100%,Rel,.,Int.(%),定量分析的方法(内标法),0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.2,2.6,3.0,Time,min,0%,50%,100%,Rel,.,Int.(%),氨基酸衍生化实验(,FDNB,法),FDNB,法的原理,2,4-二硝基氟苯（2,4-,dinitrofluorobenzene,DNFB）,也叫做,Sanger,试剂。,DNFB,在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应，生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（,dinitro,phenyl amino acid,DNP,氨基酸）,1,仪器：,四元泵,waters；,柱温箱 无；,紫外可变双波长检测器 2487;,手动进样器;,Millennia,工作站,色谱柱：,Zorbax Exclipse,XDB 150,4.6 mm 5,m,m,一仪器与试剂,仪器与试剂,保护柱：,XDB C18 4.6x12.5mm,Guard fitting Kit,化学试剂：,氨基酸标样 250，500，1000,pmol,/,mL,1%FDBN（,大连化物所可购）,磷酸二氢钾，碳酸氢钠，氢氧化钾，,乙腈，重蒸水,辅助品：,2,mL,棕色小瓶，,pH,试纸，恒温水浴箱，,溶剂过滤器，样品过滤器，,可变量程微量移液器(10-00,m,L,)。,二 实验步骤,衍生化：,于2,mL,棕色瓶里精确加入30,m,L,不同浓度的,AA,标样，30,m,L,0.5 N,NaHCO,3,(pH=9),和 1%,FDBN 10,mL,，,于 60,C,暗处加热 60,min。,放置,室温，加 1,mL,（0.01 N,pH=7.0）KH,2,PO,4,，,摇匀，待,HPLC,分析。,HPLC,条件：,流动相,A：0.04 N KH,2,PO,4,pH=7.2,流动相,B：,乙腈/水=55/45(,v/v),梯度：,B：14%4 min-10 min/40%-20 min/80%-21 min,100%,流速：1,mL,/min,检测波长：360,nm；,柱温：40,C,；,进样量：10,m,L,二 实验步骤,根据得到的数据，求算未知样品浓度,完成实验报告,思考题,为什么要保持反应溶液的碱性环境,为什么要对氨基酸进行衍生化处理,保护柱的作用是什么,反相色谱分离的原理是什么,实验中有哪些注意事项,min,0,5,10,15,20,25,mAU,0,20,40,60,80,ASP,GLU,DNP-OH,SER,HIS,ARG,GLY,THR,PRO,ALA,VAL,MET,CYS-S,IIE,LEU,PHE,LYS,TYR,实验结果,