课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA,指纹法,在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发等样品中提取的,DNA,，与犯罪嫌疑人的,DNA,进行比较，就有可能为案件的侦破提供证据。,讨论：,1.,犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是,极少量,的，刑侦人员要怎样才能得到,足够量的,DNA,呢？,2.,你还能说出,DNA,鉴定技术在其他方面的应用吗？,分子生物学研究中最强大的实验技术之一,其本质是在,体外模拟细胞内,DNA,分子复制,的过程,美国科学家,穆利斯,(,K.B.Mullis,),发明了,PCR,技术,1993,年诺贝尔奖课题,2,多聚酶链式反应扩增,DNA,片段,（一）,DNA,分子的结构,C,、,H,、,O,、,N,、,P,1.,元素组成：,脱氧核苷酸,2.,基本单位,:,一、基础知识,脱氧核苷酸,脱氧核苷,磷酸,脱氧核糖,含氮碱基,嘌呤,嘧啶,腺嘌呤（,A,）,鸟嘌呤（,G,）,胞嘧啶（,C,）,胸腺嘧啶（,T,）,一个核苷酸上的,磷酸基团上的,“,OH,”,和,另一个核苷酸分子的第,3,位碳原子上的羟基,之间失去一分子水，形成,磷酸二酯键，,即在,相邻的,两个脱氧核苷酸的,3,和,5,碳原子,之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过,3,，,5-,磷酸二酯键,彼此连接起来形成,脱氧核苷酸链,。通常将,DNA,的,羟基,“,OH,”,末端,称为,3,端,，而磷,酸基团的末端称为,5,端,3.,脱氧核苷酸链的形成,脱氧核苷酸链结构简图,1,2,4,DNA,分子的平面结构,A,T,G,C,A,G,C,T,氢键,5,端,3,端,5,端,3,端,识别,：,-OH,端为,3,;,磷酸基团的末端为,5,。,如何识别,DNA,分子的,3,端和,5,端？,（,1,）,DNA,分子是由,的（即一条链为,3,5,，另一条链为,5,3,）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则,结构。,4.,DNA,双螺旋结构特点：,（,2,）,与,交替连结，排列在外侧，构成,基本骨架,；,排列在链的内侧。,（,3,）两条链上的碱基通过,连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤（,A,）一定与,配对，,鸟嘌呤（,G,）一定同,配对。,两条反向平行,双螺旋,脱氧核糖,磷酸,碱基,氢键,胸腺嘧啶（,T,）,胞嘧啶（,C,）,（二）,DNA,的复制：,1.,概念：,由一个,DNA,形成两个完全相同的,DNA,的过程。,2.,时期：,有丝分裂间期，减数第一次分裂前的间期。,3.,场所：,细胞核（主要）、线粒体、叶绿体,4.,基本条件：,酶,:,解旋酶、,DNA,聚合酶,能量,:ATP,原料,:,四种脱氧核苷酸,模板,:DNA,的两条链,5.,复制特点：,a.,边解旋边复制,b.,半保留复制,6.,遵循原则：,碱基互补配对原则,7.,精确复制的原因,a.,规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板,b.,碱基互补配对保证了复制准确无误的进行,8.,复制的意义,:,DNA,分子通过复制将遗传信息从亲代传给了后代，保持了遗传信息的连续性。,参与的组分,在,DNA,复制中的作用,解旋酶,DNA,母链,4,种脱氧核苷酸,DNA,聚合酶,引物,总结：细胞内,DNA,复制的基本体系,打开,DNA,双链,提供,DNA,复制的模板,合成子链的原料,催化合成,DNA,子链,使,DNA,聚合酶能够从引物的,3,端开始连接脱氧核苷酸,解旋酶,DNA,母链,4,种脱氧核苷酸,DNA,聚合酶,引物,（,RNA,）,打开,DNA,双链,模板,合成子链的原料,催化子链合成,使,DNA,聚合酶能从引物,3,端开始连接脱氧核苷酸,思考：,体外扩增,DNA,时，如何提供与体内,DNA,复制相似条件？,变性,（,80,100,）,Taq DNA,聚合酶,（耐高温）,20,30,个核苷酸构成,DNA,或,RNA,二、,PCR,（多聚酶链式反应）,（一）,PCR,原理,DNA,双链,变性（加热,80-100,）,复性（缓慢冷却）,DNA,单链,变性的目的：,解开双链,复性的目的：,有利于引物,1,和引物,2,与两条单链的结合,PCR,扩增仪,PCR,扩增仪实际上就是一台能够,自动调控温度,的仪器，它可以根据,DNA,的热变性原理,，通过自动改变温度，达到扩增,DNA,片段的目的。,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,适温延伸,高温变性,低温复性,重复,1,3,步,30,轮,DNA,复制的方向：,DNA,的合成方向总是从子链的,5,端向,3,端,延伸,变性,复性（退火）,延伸,（二）,PCR,的反应过程：,二、,PCR,的反应过程,5,/,3,/,3,/,5,/,5,/,3,/,引物,5,/,3,/,引物,变性9,5,o,C,复性,55,o,C,延伸,72,o,C,5,/,3,/,3,/,5,/,5,引物,1,5,引物,2,第二次复制,第一次复制,5,5,5,5,5,5,模板,DNA,5,5,5,5,5,5,5,5,25,30,次循环（复制）后，模板,DNA,的含量可以扩大,100,万（,2,20,）倍以上。,三、,PCR,实验操作,1,、,PCR,仪,（一）设备及用具,2,、微量离心管,一种,薄壁塑料管,，总容积为,0.5mL,3,、微量移液器,用于,定量转移,PCR,配方中的,液体,，,其上的一次性吸液枪头用一次更换一次,实质上是能够,自动调控温度,的仪器,4,、离心机,一种通过高速转动产生离心现象，能将固体与液体分开的设备。,（,1,）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（,准备,）,（,2,）用,微量移液器,按配方在微量,离心管,中依次加入各组分（,移液,）,（,3,）盖严,离心管,口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（,混合,）,（,4,）将微量离心管放在,离心机,上（,离心,）,（,5,）将离心管放入,PCR,仪,上，设置好,PCR,仪的循环程序（,反应,）,循环数,变性,复性,延伸,第一次,94,，,5min,30,次,94,，,30s,55,，,30s,72,，,1min,最后一次,4,，,1min,55,，,30s,72,，,1min,（二）操作步骤：,四、结果分析与评价,DNA,含量的测定：,稀释,对照调零,测定 计算,50,倍,蒸馏水做对照,波长,260nm,处读数,（一）理论上,DNA,扩增数目的计算,四、,课题成果评价,1,、,一条,DNA,，复制,n,次，,DNA,为,2,n,2,、,a,条,DNA,，复制,n,次，,DNA,为,a x2,n,（二）实验中,DNA,含量的测定,1,、,原理,可以通过测量,DNA,含量来评价扩增的效果，,DNA,在,260nm,的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与,DNA,的含量有关,光吸收,波长,nm,260,240,220,280,0.1,0.2,2,、,过程,稀释,2,L,PCR,反应液，加入,98,L,蒸馏水，即将样品进行,50,倍稀释,对照调零,以蒸馏水作为空白对照，在波长,260nm,处，将紫外分光光度计的读数调节至零,取,DNA,稀释液,100,L,至比色杯中，测定,260nm,处的光吸收值,测定并,计算,DNA,含量（,g,/mL,）,50,(260nm,的读数,),稀释倍数,50,：,在厚度为,1cm,比色杯中的吸光值为,1,DNA,的含量为,50,g,/mL,紫外分光光度计,比色杯,体内,DNA,复制与,PCR,的技术区别：,体内复制,PCR,技术,解旋,在解旋酶作用下，细胞提供,ATP,，部分解开,加热到,94,o,C,双链全部解开，不需解旋酶,引物,一小段,RNA,一般用,DNA,片段,DNA,聚合酶,细胞自身的,DNA,聚合酶（不耐高温）,TaqDNA,聚合酶,复制特点,半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。,半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。复制的方向,子链的5,端向 3,端延伸,子链的5,端向 3,端延伸,课堂小结,多聚酶链式反应扩增,DNA,片段,PCR,原理,DNA,的复制需要酶、原料、能量、引物,DNA,的变性和复性受温度影响,PCR,过程,变性,复性,延伸,操作步骤,配制,PCR,反应体系,移入离心管,放入,PCR,仪,设置工作参数,DNA,扩增,测定含量,稀释,调零,测定并读数,计算,练习巩固：,1.,做,PCR,使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是,A.,反复洗涤,B.,不怕外源,DNA,污染,C.,高压灭菌,D.,在,-20,储存,2.PCR,技术最突出的优点是,A.,原理简单,B.,原料易获得,C.,Taq,DNA,聚合酶有耐热性,D.,快速、高效、灵活、易于操作,靶序列,靶序列,PCR,循环第一步：高温变性,靶序列,靶序列,引物,引物,5,3,5,5,3,5,3,3,PCR,循环第二步：引物与靶序列退火,靶序列,靶序列,引物,引物,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA,聚合酶,PCR,循环第三步：引物延伸,靶序列,靶序列,第,1,个,PCR,循环完成后：得到两个靶序列,