制药工艺学第十八章-维生素的生产工艺.ppt

素缺乏症”。维生素并不是补品，人体每日需要量是一定的，多摄入并不一定好，使用不当，反而会导致疾病。,概 述,维生素分为脂溶性和水溶性两大类。,脂溶性：,维生素,A,，,D,，,E,，,K,，,Q,和硫辛酸等。,水溶性：,维生素,B,1,、,B,2,、,B,6,、,B,12,、,烟酸、泛,酸、叶酸、生物素和维生素,C,等。,概 述,维生素的分类,5,名称,学名及俗名,生物作用,维生素,A,族,视黄醇,抗干眼病,维生素,D2,麦角钙化醇,抗软骨病,维生素,D3,胆钙化醇,抗软骨病,维生素,E,族,生育酚,抗不育,维生素,F,族,亚油酸，亚麻酸，花生四烯酸,降胆固醇及防血栓,维生素,K,族,叶绿醌，合欢醌，,甲基萘醌,抗出血,维生素可分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类。,水溶性维生素,名称,学名及俗名,生物作用,维生素,B,1,硫胺素,抗神经类,维生素,B,2,核黄素,抗口角溃疡，唇炎,维生素,B,3,族（维生素,PP,）,烟酸，烟酰胺,抗糙皮病,维生素,B,5,泛酸,抗癞皮病,维生素,B,6,族,吡哆醇，吡哆醛，吡哆胺,抗皮炎,维生素,B,9,族,叶酸，黄嘌呤，赤嘌呤，蝶酸等,抗恶性贫血,维生素,B,12,钴胺素，氰钴氨素，羟钴胺素等,抗恶性贫血,维生素,B,13,乳清酸,抗早衰,维生素,B,T,L,肉碱,营养强化剂,维生素,C,抗坏血酸,抗坏血病,维生素,H,（维生素,B,8,）,生物素,抗毛发脱落及脂肪代谢混乱,维生素与辅酶、辅基的关系,长期以来，人们就认识到食物中缺乏某种维生素，会导致某种疾病，维生素在机体的代谢中起着十分重要的作用，后来陆续发现大部分维生素或者其本身就是辅酶、辅基，或者是辅酶、辅基的组成部分。例如维生素,B,1,（,硫胺素），它在体内的辅酶形式是硫胺素焦磷酸（,TPP,），是,酮酸氧化脱羧酶的辅酶，又如泛酸，其辅酶形式是,C,O,A,，,是转乙酰基酶的辅酶。,概 述,生产方法,（,1,）化学合成法,烟酸、烟酰胺、叶酸、维生素,B,1,、,B,6,、,D,、,E,、,K,等。,（,2,）发酵法,B,12,、,B,2,，,维生素,C,和生物素，维生素原等。,（,3,）生物提取法,从猪心中提取辅酶,Q,10,，,从槐花米中提取芦丁，从提取链霉素后的废液中提取,B,12,等。,概 述,生产工艺,主要维生素的生产有三种方法。,1.,微生物发酵和微藻类的生物转化法,（统称生物合成法）发展非常快。,2.,化学合成法,是目前生产维生素得主要方法。,3.,天然提取法,是从富含维生素的天然食物或药用植物中浓缩、提取而得。目前只有极少数得维生素采用提取法。如维生素,A,原、维生素,E,等。,脂溶性维生素工业生产状况,水溶性维生素工业生产状况,现状,2001,年维生素,H,投产成功，我国成为世界上极少数能够生产全部维生素品种的国家。,2002,年我国维生素原料产量达,8.2,万吨，其中维生素,C,超过,5,万吨，成为世界上最大的原料药生产国和出口国。维生素制剂年产量,260,280,亿支,/,片,/,瓶，以片剂、注射液和胶囊为主。,中国科学院上海生物技术研究所发明了维生素,C,的两步发酵法，使国内维生素,C,的生产技术达到世界先进水平。,湖北广济药业公司对维生素,B2,实验室发酵生产技术的进一步改进，使其实现了维生素,B2,工业化的规模生产。,浙江新和成股份有限公司在国内首先实现了维生素,E,中间体三甲基氢醌和异植物醇的工业化生产，打破了国外维生素巨头的技术垄断。,中科院攻克的维生素,D3,生产新工艺，使国内维生素,D3,的成本低于国外同类产品,10%,15%,。,维生素中生产难度最大的产品维生素,H,在浙江医药股份有限公司及新和成公司研制成功，填补了维生素产品国产化的一个空白。,2005,年,6,月，浙江鑫富收购了湖州狮王，一跃成为全球,D-,泛酸钙的龙头。现在，占据了国际,50%,的市场和国内,90%,市场的鑫富药业在有效消化国际市场上部分存量后，自去年下半年开始对产品进行试探性提价，目前已累计上涨超过,80,，充分证明了公司在国际上的定价能力。,广济药业核黄素（维生素,B2,）国内外市场占有率也达到了,85%,和,35%,。目前年产能超过,2500,吨，,2007,年计划将核黄素产能扩大到,3000,吨。,Vc,自,91,起中国就逐渐成为全球的生产基地，仅东北制药一家就占全球,20%,的市场份额，而目前的上涨主要是由于中国各主要,VC,生产厂限制产量所至，这也充分说明了中国在国际市场中的定价能力。,18.2,维生素,C,的生产工艺,18.2.1,概述,维生素,C,又称抗坏血酸,(ascorbic acid),，能参与人体内多种代谢过程，使组织产生胶原质，影响毛细血管的渗透性及血浆的凝固，刺激人体造血功能，增强机体的免疫力。另外，由于它具有较强的还原能力，可作为抗氧化剂，已在医药、食品工业等方面获得广泛应用。,现状,维生素,C,（,vitamin C,）是目前世界上产销量最大，应用范围最广的维生素产品。目前全世界维生素,C,的产量约为,10,万吨,/,年，全球市场销售额,5,亿美元。,18.2.2,维生素的化学结构和性质,维生素,C(,多羟基不饱和内酯衍生物,),分子中有两个手性碳原子，故有,4,种光学异构体，其中,L,（,+,）,抗坏血酸效果最好，其他三种临床效果很低或无效。,18.2.3,维生素的化学结构和性质,白色粉末，无臭、味酸、熔点,190-192,，易溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚，氯仿及石油醚等。它是一种还原剂，易受光、热、氧等破坏，尤其在碱液中或有微量金属离子存在时，分解更快，但干燥结晶较稳定,。,18.2.3,生产工艺,莱氏化学合成法,二步发酵法,18.2.3.1,工艺路线发展,莱氏法化学合成（,1933,年莱氏,(Reichstein),）,莱氏法是维生素,C,生产的经典方法，是由,Reichstein,和,Grussner,研究开发的。,以,D-,葡萄糖作为起始原料，经催化加氢制成,D-,山梨醇，再经醋杆菌深层发酵氧化制得收率很高的,L-,山梨糖，,L-,山梨糖经丙酮和硫酸处理（生产上俗称丙酸化）生成双丙酮,-L-,山梨糖（简称双酮糖），再用苯或甲苯提取，提取液经水法除去单酮山梨糖后蒸去溶剂而后分离出来，用高锰酸钠氧化、水解、酯化、转化、中和便得,Vc,。,维生素,C,生产工艺,18.2.3.2,莱氏法,化学合成工艺,18.2.3.2,莱氏法工艺路线,转化,酸化,HCl,氧化NaOH,O,2,KMnO,4,酮化,H,2,SO,4,丙酮,加氢,H,2,D-,葡萄糖,D-,山梨醇,双丙酮,-L-,山梨糖,维生素,C,L-,山梨糖,酶菌氧化,O,2,双丙酮,-L-,古龙酸,2-,酮,-L-,古龙酸,维生素,C,生产工艺,18.2.3.2,莱氏法工艺过程,山梨醇发酵菌种,醋酸杆菌属可使山梨醇氧化成山梨糖。,发酵条件,温度为,26-30,，最适,pH,为,4.4-6.8,。,pH4.0,以下菌的活性受影响。,用,0.5%,酵母浸膏为主要营养源，山梨醇浓度为,19.8%,，通气量,1800ml/min,，,30,培养,33h,，山梨糖收率可达,97.6%,。,氮源：,无机氮源不能利用，使用有机氮源。,金属离子的影响：,Ni,2+,、,Cu,2+,能阻止菌的发育，铁能妨碍发酵，为了使发酵顺利进行，需用阳离子交换树脂将山梨醇中的金属离子去掉。,整个合成过程中必须保持第,4,位碳原子的构型不变；维生素,C,的总收率约,60%,。,-,国外工艺中主要采用,C-4,内酯化、,C-2,烯醇化：,酸转化：配料比,2-,酮基,-L-,古龙酸：,38%,盐酸：丙酮,=1,：,0.4,：,0.3,（质量,/,体积）,碱转化：先形成,2-,酮基,-L-,古龙酸甲酯，加,NaHCO,3,转化生成维生素,C,钠盐，经氢型离子交换树脂酸化，在,50-55,下减压烘干，得粗品维生素,C,。,18.2.3.3,两步法发酵工艺,维生素,C,的化学合成方法一般指莱氏法，后来人们改用微生物脱氢代替化学合成中,L,山梨糖中间产物的生成，使山梨糖的得率提高一倍，我国进一步利用另一种微生物将,L-,山梨糖转化为,2-,酮基,-L-,古龙酸，再经化学转化生产维生素,C,，称为两步法发酵工艺。这种方法使得维生素,C,的产量得到大幅度提高。,两步发酵法,两步发酵法是相对莱氏法而言的，即山梨醇发酵生成山梨糖后，山梨糖又经第二步细菌氧化，直接生成,2-,酮基,-L-,古龙酸，而废除了丙酮化和化学氧化两个步骤。,反应过程为,D-,葡萄糖催化加氢制山梨醇，山梨醇经发酵生成,L-,山梨糖，再经第二步发酵到,2酮基,-L-,古龙酸。,18.2.3.3,两步法工艺,18.2.3.3,两步发酵工艺,2-,酮,-L-,古龙酸,内酯化，烯醇化,生物转化,假单孢菌,D-,山梨醇,维生素,C,（,L-,抗坏血酸）,L-,山梨糖,氧化,醋酸杆菌,目前维生素,C,的生产主要采用两步发酵法。即以葡萄糖为原料，经高压催化氢化制备山梨醇，然后以山梨醇为原料经两步微生物（黑醋菌、假单孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌的混合菌株）发酵制备,2-,酮基,-L-,古龙酸，再将此酸酸（或碱）转化等工序制得粗品维生素,C,，,粗品维生素,C,经精制得成品,Vc,。,18.2.3.3,两步发酵的工艺,1 D-,山梨醇的化学合成,50%,葡萄糖溶液在,75,下加入活性炭，用石灰乳液调节,pH8.4,，加镍催化剂，通氢气，压力,3.43MPa,，反应温度,140,。反应结束后，静置沉降出去催化剂，反应液经离子交换树脂、活性炭处理后，减压浓缩，得到含量,60-70%,的,D-,山梨醇，无色透明或微黄色透明粘稠液体，收率约,97%,。,2,2-,酮,-L-,古龙酸的微生物发酵,第一步发酵：黑醋酸杆菌（从,D-,山梨醇到,L-,山梨糖）,第二步发酵：葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌混合培养,发酵罐：气升式反应器，,100,立方米。,（,3,）,2-,酮,-L-,古龙酸的分离纯化,发酵液中：,2-,酮,-L-,古龙酸,8%,，杂质有菌丝体、蛋白质和悬浮的固体颗粒等。除杂操作：加热、离心。,莱氏法是最早生产维生素,C,的方法,其以葡萄糖为原料,先经黑醋菌发酵生成,L-,山梨糖,再经丙酮化及,NaClO,氧化、水解得到,2-,酮,-L,古龙酸钠,然后进行化学合成得到维生素,C,。,此法存在着很多缺陷,如生产工艺复杂、劳动强度大、生产环境恶劣、易对人体造成伤害,因此人们不断对此工艺进行改进。,18.2.3.3,二步发酵菌种及发酵工艺,18.2.3.3.1,第一步发酵,A.,菌种,一步发酵中所用菌种为,黑醋酸杆菌,（,Gluconobacter,melagenus,），简称黑醋菌。,最常用的生产菌株为,R-30,，其主要特征是：细胞椭圆至短杆状，,G+,，无芽孢，大小为（,0.5,0.8,）,m,（,1.0,2.2,）,m,。端生草根鞭毛运动，菌落边缘整齐，微显浅褐色。生长最适温度为,3033,，氧化,D-,山梨醇的发酵收率可达,98,以上。,B.,培养基,C.,发酵过程特征,在发酵过程中，控制发酵温度,34,，初始,pH5.1,5.3,。该氧化反应的耗氧量较大，所以通气比要求,1:1 VVM,以上。即使在通气量较大，且搅拌转速较高的条件下，发酵至,4h,后溶解氧浓度急剧下降，甚至接近于零。直到,10h,左右才逐渐回升。当溶解氧浓度回复至最高点，呈水平直线时，表示该反应已达终点。,该发酵过程受山梨醇底物浓度的影响，当其浓度超过,250 g/L,时，底物对产物形成有抑制作用。故要获得高浓度山梨糖时，必须采用流加发酵方式。为了配合第二步的高浓度山梨糖流加发酵工艺，尽可能提供一步发酵的最终山梨糖浓度是至关重要的。目前山梨糖浓度可达,450 g/L,18.2.3.3.2,第二步发酵,菌种,第二步发酵采用的菌种为由大、小两株细菌组成的混合菌种。,小菌为氧化葡萄糖酸杆菌（,Gluconobacter,oxydans,），,大菌可采用巨大芽孢杆菌（,Bacillus,megateriam,），称,2980,菌，,或蜡状芽孢杆菌（,Bacillus cereus,），称,152,菌，,或浸麻芽孢杆菌（,Bacillus,macerans,），称,169,菌。,也可采用其他一些杆菌与小菌混合培养。,工业生产过程中使用最多的为,2980,及,152,混合菌。,氧化葡萄糖酸杆菌的主要特征为：细胞椭圆至短杆状，,G-,，无芽孢。,30,培养,2d,后大小为（,0.5,0.7,）,m,（,0.6,1.2,）,m,，单个或成对排列。在葡萄糖培养基上生长极微弱，甘露醇培养基上生长良好。,B.,培养基,C.,发酵过程特征,第二步发酵为混合菌种发酵。由于大、小菌两者的最适培养条件是不同的，所以其操作适宜条件是兼顾大、小菌两者的条件。通常操作温度为,30,；初始,pH,控制在,6.8,左右。该反应虽属氧化反应，但对氧的消耗并不很大。气升式发酵罐非常适合该发酵过程。溶氧浓度控制在,20,即可。,山梨糖的初始浓度对产物的生成影响较大。间歇发酵时初始山梨糖浓度超过,80 g/L,，会对产物生成产生抑制。所以需采用高浓度山梨糖流加发酵方式。若采用建立在数学模型基础上的流加控制策略，二步收率可达,83,。,18.2.3.3.3,2-,酮基,-L-,古龙酸的分离原理,山梨醇经两步微生物发酵主要生成,2-,酮基,-L-,古龙酸，使发酵液酸度提高，为了保证产酸正常进行，必须定期滴加灭菌的碳酸钠溶液调,pH,值，使,pH,值保持,7.0,左右，这样发酵终点所得溶液是含古龙酸钠及少量古龙酸的发酵液。在发酵终点时，用于发酵的芽孢杆菌菌体已逐步自溶成碎片使大量的菌体蛋白溶入发酵液中。因此，,发酵液中除了含有一定量的,2-,酮基,-L-,古龙酸钠及,2-,酮基,-L-,古龙酸外，还含有大量的菌体蛋白。,要将,2-,酮基,-L-,古龙酸钠从发酵液中分离提取出来，必须先除去菌体蛋白。,除去菌体蛋白，可将发酵液用盐酸酸化调至菌体蛋白等电点，使菌体蛋白沉淀，静置数小时后去掉菌体蛋白。除去菌体蛋白的发酵液中含,2-,酮基,-L-,古龙酸钠及,2-,酮基,-L-,古龙酸，由于,2-,酮基,-L-,古龙酸钠（能解离为阴、阳离子），用,732,阳离子交换树脂进行交换可去掉其中,Na+,而得,2-,酮基,-L-,古龙酸稀液。高温下,2-,酮基,-L-,古龙酸不稳定，所以为了浓缩古龙酸溶液使其达到一定浓度，可采用减压浓缩的方法。由于 低温下,2-,酮基,-L-,古龙酸溶解度较小，所以可经冷却结晶得,2-,酮基,-L-,古龙酸晶体，从而实现了从发酵液中提取分离,2-,酮基,-L-,古龙酸的操作过程。,1,工艺过程,2-,酮基,-L-,古龙酸的制备工艺过程如下图所示：,（,1,）离子交换 将发酵液冷却后用盐酸酸化，调至菌体蛋白等电点，使菌体蛋白沉淀。静置数小时后去掉菌体蛋白，将酸化上清液以,(2,3)m,3,/h,的流速压入一次阳离子交换柱进行离子交换。当回流到,pH3.5,时，开始收集交换液，控制流出液的,pH,值，以防树脂饱和，发酵液交换完后，用纯水洗柱，至流出液古龙酸含量低于,1mg/ml,以下为止。当流出液达到一定,pH,值时，则更换树脂进行交换，原树脂进行再生处理。,18.2.3.3,酮基,-L-,古龙酸的制备工艺,将经过一次交换后的流出液和洗液合并，在加热罐内调,pH,至蛋白质等电点，然后加热至,70,左右，加,0.3%,左右的活性炭，升温至,90,95,后再保温,(10,15)min,，,使菌体蛋白凝结。停搅拌，快速冷却，高速离心过滤得清液。,将酸性上清液打入二次交换柱进行离子交换，至流出液的,pH1.5,时，开始收集交换液，控制流出液,pH1.5,1.7,，,交换完毕，洗柱至流出液古龙酸含量在,1mg/ml,以下为止。若,pH1.7,时，需更换交换柱。,（,2,）减压浓缩结晶 先将二次交换液进行一级真空浓缩，温度,45,，至浓缩液的相对密度达,1.2,左右，即可出料。接着，又在同样条件下进行二级浓缩，然后加入少量乙醇，冷却结晶，甩滤并用冰乙醇洗涤，得,2-,酮基,-L-,古龙酸。,如果以后工序使用碱转化，则需将,2-,酮基,-L-,古龙酸进行真空干燥，以除去部分水分。,（,1,）,pH,值,发酵液在上柱之前,pH,值非常重要，因为,调好等电点是凝聚菌体蛋白的重要因素。,pH,偏高偏低都会使上柱发酵液中的蛋白含量升高，进而污染交换树脂，使离子交换效率下降。,（,2,）交换液流速,交换液流速过小，树脂处理能力下降，流速过快，交换效率会下降，因此交换液流速的确定要保证有较高的交换率的前提下，提高树脂层的处理能力，生产上一般维持在,(2,3)m,3,/h,。,（,3,）,树脂的再生程度 树脂再生的好坏直接影响,2-,酮基,-L-,古龙酸的提取，标准为进出酸差小于,1%,、无,Cl,。,（,4,）,浓缩温度 浓缩温度取决于真空度，真空度高浓缩温度低，但动力消耗大，汽化量大容易跑料；真空度低时，浓缩温度高，料液易,炭化。生产上一般,控制在,45,左右较好。,2,工艺控制及影响因素,18.2.3,两步发酵法 优势,1.,以生物氧化代替化学氧化，省掉了酮化反应；,2.,节约了大量易燃、易爆、有毒的化工原料，大大减少了“三废”处理，改善了劳动条件，利于安全生产；,3.,减少工业用粮、生产工序和生产设备，缩短了生产周期，降低了原料成本；,4.,与国外二步发酵法比较，其发酵规模和产酸量均居领先地位。,例子,1983,年北京制药厂年产,150,吨维生素,C,车间为例，采用二步发酵法新工艺后，每年可节约丙酮,297,吨（相当于,237.8,万斤粮食）；节省其他化工原料,2600,多吨和主要设备,58,台；降低了原料成本,10%,。,两者比较,现将,1983,年的两步发酵法与莱氏法进行同等生产规模的经济指标比较，其优缺点如下：,（,1,）原料消耗 两步发酵法原料总单耗比莱氏法减少,31.2%,。,（,2,）成本 两步发酵法原料成本比莱氏法降低了,23,3,，工厂成本降低了,3,6%,。,（,3,）质量 差别不大，在外观、含量、烘烤消光值、分解点、细度等主要控制项目上，两步发酵法略优；但在加速破坏试验中，莱氏法产品稳定性较好。,（,4,）能耗 两步发酵法比莱氏法高出,15,。,（,5,）总收率（对山梨醇）莱氏法比两步发酵法高出,10,左右，主要原因是第二步微生物氧化收率仍较低。,（,6,）安全 两步发酵法由于革除了丙酮、苯（或甲苯）、氯气等大量易燃易爆或有毒的化工原料，有利于安全生产。,The end,