细胞游离亚铁原卟啉检测技术资料.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,细胞游离亚铁原卟啉,检测技术,作者：温鑫,细胞游离亚铁原卟啉（Cells Free Ferrous Protoporphyrin FH）是恶性肿瘤发生过程中产生的因果性生物标志因子,。,FH,是,含,亚铁原卟啉蛋白的分解产物。,FH具有强氧化作用，导致细胞自稳调节功能紊乱。,FH含量具有连续可测量性，且与细胞癌变程度呈密切正相关。采用直接生物学介质（组织渗液）进行靶向定位检测，即可显示细胞恶变过程。,细胞游离亚铁原卟啉,（FH）,主要,来源,线粒,体,膜间腔,嵴间腔,DNA,基粒,外膜,内膜,核糖体,嵴,嵴内腔基质,基质,颗粒,线粒体的超微结构,膜间腔,嵴内腔,嵴间腔,基粒,抑制剂,可溶性的,ATP,酶,寡酶素敏感蛋白（,OSCP,）,HP,蛋白,线粒体内含,亚铁原卟啉,的,蛋白,主要,包括,：,铁硫蛋白、辅酶,Q,、,细胞色素,等；,ATP,合,酶,、,过氧化氢酶、过氧化物酶、,单胺氧化酶,、,血红素加氧酶、,NAD,（,P,）,H,氧化酶、鸟氨酸氧化酶,、,一氧化氮合成酶,、,腺苷酸激酶,、,细胞色素氧化酶,、,苹果酸还原酶,等120余种酶类。,在病理情况下，亚铁原卟啉,从细胞蛋白析出，,成为,细胞,游离亚铁原卟啉，不仅没有生物学功能，反而能引起细胞和组织,器官的氧化,损伤。,细胞游离亚铁原卟啉,（FH）,生成机制,【细胞能量代谢重编程】,ATP,ADP,肌酸,磷酸,肌酸,P,P,机械能,(,肌肉收缩,),渗透能,(,物质主动转运,),化学能,(,合成代谢,),电能,(,生物电,),热能,(,维持体温,),生物体内能量的储存和利用都以,ATP,为中心。,糖,脂肪,蛋白质,葡萄糖,脂酸,+,甘油,氨基酸,乙酰,CoA,TAC,2H,呼吸链,H,2,O,ADP+Pi,ATP,CO,2,：分解,：氧化分解,：氧化磷酸化,诺贝尔奖获得者德国生物化学家奥托.海因里希.瓦博格（Otto Heinnich Warburg）发现肿瘤细胞的耗糖速度是正常细胞的10倍，却仅产生1/10的能量。肿瘤细胞主要通过,磷酸戊糖途径,产能，使即便在有氧情况下有氧氧化过程也不能对糖酵解产生抑制，这称为瓦博格氏效应（Warburg effect）。,以,6-,磷酸葡萄糖开始，在,6-,磷酸葡萄糖脱氢酶催化下形成,6-,磷酸葡萄糖酸，进而代谢生成以磷酸戊糖为中间代谢物的过程，称为磷酸戊糖途径，简称,PPP,途径。,反应部位：胞浆,重要反应产物：,NADPH,、,5-,磷酸核糖,限速酶（启动因子）：,6-,磷酸葡萄糖脱氢酶,6-,磷酸葡萄糖脱氢酶的活性,与抑癌基因,p53,有关。,p53,基因因编码一种分子质量为,53kDa,的蛋白质而得名，是一种,抑,癌基因。一旦,p53,基因发生突变，,P53,蛋白失活细胞分裂失去节制，发生癌变。,在正常情况下,p53,与葡萄糖,-6-,磷酸脱氢酶相结合,抑制它的活性,，,阻止磷酸戊糖途径进行,细胞中的葡萄糖主要通过三羧酸循环产生能量。,在,p53,发生突变或缺失的肿瘤细胞中,失去了对葡萄糖,-6-,磷酸脱氢酶的抑制,该酶作为戊糖磷酸途径,的,启动因子，,使,葡萄糖通过戊糖磷酸途径代谢,。,1、耗能；,2、,产生大量还原型辅酶,（,NADPH,）,进行生物合成,；,3、改变细胞微环境。,致癌因素,阻抑蛋白,p53,葡萄糖,-6-,磷酸脱氢酶,P53突变,突变的,p53,葡萄糖,-6-,磷酸脱氢酶,葡萄糖,-6-,磷酸脱氢酶激活,启动因子,葡萄糖,戊糖磷酸代谢途径,TAC,NADPH,果糖-6-磷酸,3-,磷酸甘油醛,二氧化碳,抑制,Warburg,效应形成的细胞微环境,紊乱,低氧,（氧稳态紊乱）,酸性环境,（酸碱平衡紊乱）,还原性状态,（氧化-还原平衡紊乱）,FH,位于细胞,含,亚铁原卟啉,蛋白的肽链靠近表面的一个疏水核内，它主要依靠,Fe2+,与,F8His,的咪唑氮配位而挂在,Pr,链上。但是它之所以能固定在蛋白质的固定位置上而且取向一定，主要是因为还有大约,21,个残基逼近,FH,，距离在,4A,之内，这些残基中有,60,多处与,FH,比较靠近，可以发生极性与非极性的相互作用，足以保持,FH,在细胞蛋白中的位置。,FH,的极性部分丙酸基侧链伸向亲水的表面，在生理,pH,下解离成负离子，在,链中，有一个丙酸基与,CD3His,相连；在,链中，,FH,的两个丙酸基分别与,CD3Ser,和,E10Lys,相连。,FH,与肽链之间的静电引力对于维持,FH,在细胞,含亚铁原卟啉,蛋白中的位置有很大作用。,谷胱甘肽过氧化物酶以还原型谷胱甘肽,(GSH),作为供氢体来分解,H,2,O,2,，生成氧化型谷胱甘肽,(GSSG),，使细胞内,GSH:GSSG,的比率下降。,GSH,生成,GSSG,过程中形成肿瘤细胞的低氧状态，,激活氧感受器,和,缺氧信号传导通路,。,FH,的极性部分丙酸基侧链伸向亲水的表面，在生理,pH,下解离成负离子，在,链中有一个丙酸基与,CD3His,相连；在,链中，,FH,的两个丙酸基分别与,CD3Ser,和,E10Lys,相连。,FH,与肽链之间的静电引力对于维持,FH,在细胞,含亚铁原卟啉,蛋白中的位置有很大作用。,氧感受器分子,导致蛋白质的巯基由氧化型向还原型转变，,促使缺氧特异性转录因子,-,低,氧诱,导,因子,（,hypoxia-inducible factor,；,HIF,）,HIF-1a,的磷酸化并与,HIF-1b,结合而形成一个完整的,HIF-1,转录复合体，从而与相应靶基因上的缺氧反应元件,(HRE),结合，促进基因的表达,.,并通过第二信使,-,活性氧族,(ROS),与激酶系统发生联系，激活,下游,酶系统,。,细胞在代谢过程中,通过,Fenton,反应,产,生产生一系列活性氧,族,（reactive oxygen species,ROS），包括：O,2,-、H,2,O,2,及HO,2,、,OH等。ROS 可双向调控细胞的凋亡和增殖，机体内的自由基通过其浓度调节着机体细胞的生死平衡，对转录因子的激活以及对细胞增殖的促进。,由于瓦格博效应，在低氧诱导因子（,hypoxia inducible factor,，,HIF,）的介导下，,血管内皮生长因子,（,V EGF,）,mRNA,转录和稳定性增加，且,VEGF,受体表达上调，,VEGF,的生物学效应增强。,其表达的结果是增加血管分支形成,增强血流量,。,HIF-1a,、ROS、,V EGF,表达上调，,使一种亲脂性物质（,Hydrophilic fatty molecules,）进入细胞,含亚铁原卟啉,蛋白疏水核内，它所带的负电荷中和了肽链上,His,、,Lys,所带的正电荷，使它们不再与,FH,丙酸基侧链保持静电吸引，从而使,FH,在细胞蛋白中脱落。,瓦博格,效应,NADPH,增加,GSH,增加,激活,氧感受器,和,缺氧信号,传导通路,缺氧特异性转录因子,HIF-1a,活性增强,激活,第二信使,-ROS,与激酶系统,EPO,基因,表达水平升高,NADPH,氧化酶,H,2,O,2,下降,cGMP,抑制,激活,鸟苷酸环化酶,VEGF,表达上调,血红素氧合酶,及,NOS,活性抑制,内源性,CO,及,NO,下降,FH释放,代谢改变,HIF-1,V EGF,不典型增生,癌前病变,原位癌,浸润癌,细胞增生,形态学改变,低氧、还原态,ROS,瓦博格,效 应,链,CD3His,链,CD3Ser,、,E10Lys,酶蛋白,FH,p53,等基因突变,致癌因素,Hfm,细胞高增生,低凋亡,低分化,低氧代谢通路,还有的学者,特别强调自由基的作用，,认为亲脂性物质进入,含亚铁原卟啉,蛋白疏水核，与,蛋白,中心的,Fe,2+,通过,Fenton,反应,产,生,OH,。,OH,具有极高的氧化还原,态,势，反应力极强，几乎可以和生物细胞内所有类型的分子以,s-1,化学反应,0,级,（,相当于几个,飞秒,，,1,飞秒只有,1,秒的一千万亿分之一,）,的反应速率作用。,但是，,OH,寿命短暂，因而最靠近,OH,的部位受到攻击的可到性也最大,。位居线粒体内膜,基粒基片,的含亚铁原卟啉,蛋白由于在空间位置上的态势，首先受到,OH,的攻击，共价键断裂，其结构遭到不可逆转的破坏，,FH,析出。,FH对细胞氧化损伤,可能的,作用,靶点：,1、细胞周期,各期交叉处存在,的,检查点（checkpoint）,及,核染色体基因组（,nucleic genome),；,2、线粒体基因组,(mitochondrial genome),；,3、,细胞囊泡（Vesicles）运输调控机制,。,DNA,损伤检查点,（,DNA damage checkpoint,）,DNA,复制检查点,（,DNA replication checkpoint,）,纺锤体组装检查点,（,spindle assembly checkpoint,）,人类具有两个基因组：,核,/,染色体基因组（,nucleic genome),线粒体基因组,(mitochondrial genome),一般认为线粒体基因组（,mtDNA,）的自发突变率远较核基因组（n,DNA,）高，约,10-20,倍。,mtDNA在nDNA内的整合可能通过两条途径引起细胞癌变：,1、,通过引起核基因组的不稳定性发生癌变；,2、,通过改变细胞能量产生，提高线粒体氧化压力，引起线粒体酶表达异常和/或调控凋亡等途径来影响细胞的生物学行为，使其发生恶变。,囊泡运输是生命活动的基本过程，细胞内的膜性细胞器之间的物质运输(如蛋白质、脂类)，主要是通过囊泡完成的。囊泡,是细胞内物流的集装箱。,钙离子是囊泡释放的开关,。苏德霍夫发现，囊泡表面有一种结合蛋白，该蛋白只有在钙离子定向流动时才能与细胞膜表面的另一种蛋白结合，从而促进囊泡运输功能。,FH的氧化损伤作用使线粒体出现单价电子渗漏（univalent leak）；胞内,Ca,2+,超载，触发线粒体摄取,Ca,2+,并使,Ca,2+,在线粒体内积聚,。,线粒体,氧化损伤使,Ca,2+,定向流动发生异常，不能与细胞膜表面的特定蛋白结合，从而损害囊泡运输功能。囊泡运输功能,的破坏是细胞恶变的重要通路。,P53基因,突变,FH物质,析出,检查点功能受损,细胞周期稳态失调,细胞功能,紊乱,mtDNA氧化损伤,基因组稳态失调,细胞形态,紊乱,细胞钙通路障碍,囊泡运输功能失调,关于,细胞,癌变(carcinogenesis)的具体机理还存在争议和分歧。,1、,体细胞突变（somatic mutation）假说,：,主要包括基因突变(gene mutation)假说和非整倍体(aneuploidy)假说,；,2、,表型遗传修饰（epigenesis）改变假说,；,3、,肿瘤干细胞假说,；,4、,对称分裂抑制机制紊乱假说,；,5、,干细胞不对称分裂机制紊乱假说,（1）,基因突变与干细胞不对称紊乱,；,（2）,非整倍体与干细胞不对称分裂紊乱,；,（3）,表型遗传改变与干细胞不对称分裂紊乱,；,（4）,细胞永生化与干细胞不对称分裂机制紊乱,。,成体干细胞,不对称分裂紊乱,根据,生物全息律,理论，,生物体的一个部分,（细胞）,包含全部整体信息,。,肿瘤发生过程是体细胞,的,全能性表现过程，只不过,是,表现出结构和功能只适应特殊的局部环境而,与,整个机体不协调,，,是一 种,对称破缺紊乱或影像对称（手性特征）破缺紊乱。,生命的基本物质是生物大分子，它包括蛋白质、核酸、多糖和脂类。其中蛋白质是生命功能的执行者，组成生物蛋白质的氨基酸都是L型,（左旋）,的,；,核酸是遗传信息的携带者和传递者,，,通常是右旋的。这是生物大分子的手性特征。生物体内化合物的这种左右不对称性,（对称破缺）,正是生命力的体现,，,人类自身都是对称性自发破缺的产物。,对称破缺紊乱是病理的结果。,粒子物理学中的对称破缺问题与未知的力有关,。,粒子物理学中的许多理论,如量子,色,动力学,爱因斯坦的广义相对论,都是源于对称的.可是我们的世界又是不对称的.这表明除了已经知道的强力,电磁力,弱力和引力外可能存在未知的力,这个力是引起对称破缺的原因.如果我们了解这个力,就有可能知道对称破缺的机制,就能知道不对称性的起源,进而就有可能了解质量(包括暗物质)的来源，也就能真正明了世间万物的产生机理。,综之，,机体在各种致癌因素作用下，,可能由于细胞游离亚铁原卟啉氧化损伤作用的参与，细胞稳定性紊乱，,在基因水平上失去,了,正常调控，,可能导致细胞,对称分裂抑制机制紊乱,，或者,导致,干细胞不对称分裂机制紊乱,。,表型遗传修饰改变,的细胞,克隆性增生,，形成恶性,肿瘤。,致癌因素,细胞能量代谢,重编程,细胞内环境,紊乱,细胞形态,紊乱,细胞功能,紊乱,氧稳态紊乱,酸碱平衡紊乱,氧化-还原态平衡紊乱,细胞周期功能紊乱,线粒体功能紊乱,囊泡运输功能紊乱,表型遗传修饰,机制紊乱,细胞,对称分裂抑制机制紊乱,干细胞不对称分裂机制紊乱,细胞癌变,瓦博格氏,效应,细胞游离亚铁原卟啉,检测,最适宜领域,群体性筛检,（,mass,screening,）,癌前期,无症状早期癌,中晚期,死亡,筛查,筛查,检查,看病,可预防,不改变预后,可长期存活,筛检试验,诊断试验,对象不同,健康人或无症状的病人,病人,目的不同,把病人及可疑病人与无病者区分开来,把病人与可疑有病但实际无病的人区分开来,要求不同,快速、简便、高灵敏度,科学性、准确性,费用不同,简单、廉价,一般花费较贵,处理不同,须进一步作诊断试验以便确诊,结果阳性者要随之以治疗,筛检试验技术五大要素,准确,、,快捷,、,经济,、,易接受,与后续的诊断能保持连续性,细胞游离亚铁原卟啉,检测基本符合上述要求，是癌症筛查的适宜技术。,细胞游离亚铁原卟啉,（FH）,连续可测量性,【,上皮细胞FH检测技术】,采用一种脂溶性较强的物质，使之很容易进入细胞与细胞器中，其与,FH,物质的氧化,-,还原产物使上皮细胞内含有的内源性过氧化物酶等酶染色。作为筛查手段，观察,组织,渗液上皮细胞中,FH,物质对细胞内酶的染色情况，即可显示上皮细胞是否存有恶变及其程度。,因细胞内酶的差异，同一含量FH显色可能略有不同。,技术特色,1、细胞游离亚铁原卟啉是一种因果性生物标志因子，是细胞稳定性失调、肿瘤发生过程细胞代谢变化的必然产物。因而用以检测恶性肿瘤敏感度高。,2、本技术采用直接生物学介质进行检测，是一种靶向定位检测，因而用以检测恶性肿瘤特异度高。,3、这种代谢改变的肿瘤细胞是全息性的，是体细胞全能性不协调的表现，因而用以检测恶性肿瘤具有广谱性，适用范围广。,4、简约设计；床边诊断技术，可自检，快速、廉价；操作简便，采样后的检测过程只需3分钟内即可得出检测结果。,生物学介质和检测范围,宫颈渗液,：,宫颈癌,直肠渗液,：,直肠癌,鼻咽部渗液,：,鼻咽癌,前列腺液：前列腺癌,痰液：肺癌 乳头溢液：乳腺癌,宫腔渗液,：,子宫内膜癌、绒毛膜上皮癌,。,体表部位增生、溃疡、糜烂等处的组织渗液,：,肛管癌、阴茎癌、外阴癌、口唇癌、舌癌、牙龈癌、乳房外湿疹样癌,、,鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、恶性黑色素瘤、隆突性皮纤维肉瘤、淋巴管肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、体表转移癌等。,【,参考文献,】,【1】Gatenby R A，Gilles R J Why do cancer have hagh aerobic glycolysis?.Nat Rev Cancer，2004,4（11）891-899,【2】Hiroshi Kondon，Cellular life span and the Warburg effect【J】.Exy Cell Res，2008,314（9）1923-1928,【3】Wu Mian.P53 regulates biosynthesis throuth direct inactivation of glucose-6-phosphate Nature Cell Biology 2011，（13）310-316,【4】Basanta D，Simon M，Deutsch A，et al.Evolutionary game theory elucidates the role of glycolysis in gliama progresion and invasion【J】.Cell prolif，2008，41（6）：980-987,【5】Yeung S J，Pan J，Lee M H.Roles of p53，Myc and HIF-I in regulation glycolysisthe severth hallmaek of cancer【J】.Cell Moi life Sci，2008，65 （24）：3981-3999,【6】Band V，Karin M.Signal transduction by tumor necrosis fador and is relatives.Yrends Cell Biol，2001,11:372-377,【7】Ashrafian H.Cancer,s sweet tooth：Janus effect of glucose metabolism in tumonigenesis【J】.Lancet，2006，367（9510）618-621,【8】Semenza GL，Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-mducible factor 1 Annual Review Cell Developmental Biology，1999:15:551,【9】Guhaniyogi,J.and G.Brewer,Regulation of mRNA stability in,mammalian cells.Gene,2001.265(1-2):p.11-23.,【10】Bensand K，Tsurta A，Sajak M A，et al，TIGAR，a p53-inducible regulator of gdycolysis and apoptosis【J】，Cell，2006，126（1），107-120,【11】Kondon H，Lleonart M E，Cil J，et ai，Glycolytic enzymes can modulate cellular life span【J】，Cancer Res，2005，65（1）：177-185,【12】,黄耿文,杨连粤.肿瘤细胞的缺氧信号传导通路.世界华人消化杂志,2002;10(12):1441-1444,【13】Hausenioy DJ,Yelion DM,Survivial kinases in ischemic preconditioning and postconditioning.Cardivascular Research,2006,70；240-253,【14】Kutala V K，Parinandi N L，Zweier J L，Kuppusamy P.Arch Biochem Biophys，2004，424：81-88,【,15】Lee MH，Yang HY，Reguiation of G1 cyclin-dependent kinases and ancers.Cancer Metastasis Rev.2003，22（4）：435-449,【16】,吴伟康：细胞增殖、分化、凋亡异常与疾病，见：陈主初，主编，病理 生理学 北京：人民卫生出版社，,2005,15-33,【17】Loyer P，Trembley JH，Kidd VJ，Lahti JM.Role of CDK/cyclin compiexes in transcription and RNA spicing.Cell Signal，2005,17（9）；1033-1051,【18】,Yamashita YM,Jones DL,Fuller MT.Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome J.Science.2003,301(5639):1547-50.,【19】,Dlugosz A,Merlino G,Yuspa SH.Progress in cutaneous cancer research J.J Investig Dermatol Symp Proc.2002,7(1):17-26.,【20】,Yuspa SH.The pathogenesis of squamous cell cancer:lessons learned from studies of skin carcinogenesis-thirty-third G.H.A.Clowes Memorial Award Lecture J.Cancer Res.1994,54(5):1178-89.,【21】,Cahill DP,Kinzler KW,Vogelstein B,et.al.Genetic instability and darwinian selection in tumours J.Trends Cell Biol.1999,9(12):M57-60。,【22】,Pihan G,Doxsey SJ.Mutations and aneuploidy:co-conspirators in cancer J?Cancer Cell.2003,4(2):89-94.,【23】,Cairns J.Somatic stem cells and the kinetics of mutagenesis and carcinogenesis J.Proc Natl Acad Sci U S A.2002,99(16):10567-70.,【24】,Cohen SM,Ellwein LB.Genetic errors,cell proliferation,and carcinogenesis J.Cancer Res.1991,51(24):6493-505.,【25】,Preston-Martin S,Pike MC,Ross RK,et.al.Increased cell division as a cause of human cancer J.Cancer Res.1990,50(23):7415-21.,【26】,Cohen SM,Ellwein LB.Cell proliferation in carcinogenesis J.Science.1990,249(4972):1007-11.,【27】,Cohen SM.Role of cell proliferation in regenerative and neoplastic disease J.Toxicol Lett.1995,82-83:15-21.,【28】,Ames BN,Gold LS.Re:E.Farber,Cell proliferation as a major risk factor for cancer:a concept of doubtful validity J.Cancer Res.,55:3759-3762,1995.Cancer Res.1996,56(18):4267-9;author reply 4272-4.,【29】,Surani MA.Reprogramming of genome function through epigenetic inheritance J.Nature.2001,414(6859):122-8.,【30】,Ferguson-Smith AC,Surani MA.Imprinting and the epigenetic asymmetry between parental genomes J.Science.2001,293(5532):1086-9.,【31】,Chakhparonian M,Wellinger RJ.Telomere maintenance and DNA replication:how closely are these two connected J?Trends Genet.2003,19(8):439-46.,【32】,Wright WE,Shay JW.Historical claims and current interpretations of replicative aging J.Nat Biotechnol.2002,20(7):682-8.,【33】,Shay JW,Wright WE.Hayflick,his limit,and cellular ageing J.Nat Rev Mol Cell Biol.2000,1(1):72-6.,【34】,Egger G,Liang G,Aparicio A,et.al.Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy J.Nature.2004,429(6990):457-63.,【35】,Jones PA.Epigenetics in carcinogenesis and cancer prevention J.Ann N Y Acad Sci.2003,983:213-9.,【36】,Ushijima T.Detection and interpretation of altered methylation patterns in cancer cells J.Nat Rev Cancer.2005,5(3):223-31.,37】,Hayflick L.The illusion of cell immortality J.Br J Cancer.2000,83(7):841-6.,【38】,Merok JR,Sherley JL.Breaching the Kinetic Barrier to In Vitro Somatic Stem Cell Propagation J.J Biomed Biotechnol.2001;1(1):25-27.,【39】,Bell E,Marek LF,Levinstone DS,et.al.Loss of division potential in vitro:aging or differentiation J?Science.1978,202(4373):1158-63.,欢迎批评,欢迎指导,