细胞培养的基本方法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞培养的基本方法,细胞培养的基本概念,2,细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内,环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一,一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，,也可以是细胞群。,细胞培养的目的与用途,2,一,、,基础研究,(1)药物作用机理,(2)基因功能,(3)疾病发生机理,二,、,科学研究,:,(1)新药筛选:如药效研究,中药有效成分筛选等.,(2)疫苗研究与开发:,如,肝炎疫苗,艾滋病疫苗,肿瘤疫苗,等.,(3),基因工程药物,与细胞工程药物的,研究与开发,(,4,)单克隆抗体制备,细胞培养主要的设施器材,2,设施：,超净台、恒温培养箱、,倒置显微镜,、液氮储存罐、,冰柜、恒温,水浴槽、,离心机、,压力,蒸汽消毒器,。,器材,：,一、,玻璃,器材,玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等，（现已较少使用）。,二、塑料器材,多孔培养板（,6,12,24,48,96,）、培养皿、培养瓶、离心管、冻存管。,三、橡皮器材,橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或试管的,塞子,、盖子。,四、金属器材,剪刀,、镊子、,手术刀,、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头,五、其他物品,纱布、,注射器,、针头、滤头,细胞培养的条件,（,1,）适宜的温度和,PH,37,，,pH7.27.4,。,（,2,）气体环境,95%,空气,+,5%CO,2,;,适宜的湿度（,无菌水不能干掉,）。,（,CO,2,：细胞生长所必需的成分,pH,值维持，最低不能低于,1%,。）,（,3,）营养物质,N,源、,C,源、无机盐、维生素、,H,2,O,，细胞培养基中含有。,常用的细胞培养基：,DMEM,，,RPMI-1640,，,BME,，,M199,等。,（,4,）无菌条件,紫外消毒、空气过滤、无菌滤头，高压灭菌、严格操作。,设施、器材、试剂实物图,培养细胞的分类,按照是否贴壁：,贴壁细胞：大多数属此类细胞如肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质,细胞等。,悬浮细胞：主要为取自血、骨髓、脾的细胞，如白血病细胞。,按照传代次数：,原代细胞：即从体内取出组织接种培养而未经传代的细胞。（也有人把传代,10,次之,内的细胞统称为原代细胞。）,细胞系：指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。如,HeLa,细胞、,CHO,细胞等。,原代培养,原理：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、,螯合剂（常用,EDTA,）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培,养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。,原代培养方法：消化培养法、组织块培养法。,原代消化培养法,（,1,）处理组织用,Hanks,液漂洗组织,23,次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先,置于含有青链霉素的混合液中,3060,分钟。,（,2,）剪切：将组织切成,23,毫米大小的块，加入胰蛋白酶液，然后一并倒入培养皿中。,（,3,）消化：置于,37,温箱消化，每隔,20,分钟摇动一次。消化时间依组织块的大小和,组织的硬度而定。,（,4,）分离：用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，,立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速,（,5001000,转,/,分）离心收集细胞，弃上清。,（,5,）,加入适量培养基重悬细胞,，分装入培养瓶中，补足培养基。,（,6培养：置于,37,，,5%CO,2,温箱培养。,原代组织块培养法,（,1,）剪切：用,Hanks,液漂洗二三次以去掉组织块表面血污，剪成,1mm,3,小,块。,（,2,）摆布：将组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以,0.5cm,为宜，每一,25ml,培养瓶底可摆布,2030,块。,（,3,）轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，盖好瓶塞，,置,36.5,温箱培养,2,小时左右（勿超过,4,小时），使小块微干涸。,（,4,）培养：从微箱中取出培养瓶，,46,度斜持培养瓶，向瓶底脚部轻轻注入培养液少,许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块。,置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。,细胞的传代,细胞传代的概念：,随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将原有细胞分成几部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养，这个过程就称为传代（,passage,）。,传代方法：,悬浮细胞传代、贴壁细胞传代。,细胞的传代,悬浮细胞传代,：（,1,）收集细胞悬液；,（,2,）离心（,1000,转,/,分，,2,分钟）；,（,3,）弃上清；,（,4,）加入新鲜培养基重悬细胞；,（,5,）按照适当比例接种到新的培养皿；,（,6,）补足培养基；,（,7,）放于温箱培养。,重悬,分装,放入温箱,细胞的传代,贴壁细胞的传代：,（,1,）吸去陈旧培养基，并用,PBS,清洗细胞表面；,（,2,）加入胰酶消化细胞；,（,3,）加入新鲜培养基终止胰酶消化；,（,4,）将细胞吹打下来，收集，离心；,（,5,）弃上清；,（,6,）加入新鲜培养基重悬细胞；,（,7,）按照适当比例接种到新的培养皿；,（,8,）补足培养基；,（,9,）放于温箱培养。,终止胰酶消化并吹打,重悬,分装,放入温箱,吸去旧培养基，,PBS,清洗,加入胰酶消化,细胞的换液,悬浮细胞换液：收集细胞悬液、离心、弃上清、加入新鲜培养基重悬、补足培养基。,或者直接从旧瓶吸取一定细胞悬液加入新瓶，补足新鲜培养基即可。,贴壁细胞换液：弃去陈旧培养基、,PBS,清洗细胞表面、加入新鲜培养基。,细胞的冻存,悬浮细胞的冻存：,（,1,）配制冻存液（胎牛血清：二甲基亚砜,9:1,），每个冻存管需要,冻存液,1ml,。,（,2,）收集细胞悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分装至冻,存管中，并立刻放入冻存盒内，放入,-80,冰箱，第二日转存,于液氮中。,细胞的冻存,贴壁细胞的冻存：,（,1,）配制冻存液。,（,2,）弃去陈旧培养基，,PBS,清洗细胞表面，胰酶消化，终止消化，,吹打细胞，收集悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分,装至冻存管中，并立刻放入冻存盒内，放入,-80,冰箱，第二,日转存于液氮中。,吸去旧培养基，,PBS,清洗,加入胰酶消化,终止胰酶消化并吹打,细胞冻存的注意事项：,（,1,）冻存液要最先配置。,原因一：二甲基亚砜（,DMSO,）在加入血清时会产热损伤细胞。,原因二：如果先用血清重悬细胞，再加入,DMSO,，则局部,DMSO,浓度过高，会,对细胞造成严重损伤（,DMSO,在室温下对细胞有害），影响日后的复苏。,（,2,）冻存时要求细胞状态良好，最好是取对数期细胞冻存，以保证复苏后的存活率。,（,3,）最大限度的减少,DMSO,在室温下和细胞接触的时间。,（,4,）冻存时要,缓慢降温（慢冻），,用细胞冻存盒可以做到每分钟降低,1,，细胞冻,存盒应先放在,4,预冷，以减少细胞和,DMSO,在室温接触的时间；如果没有冻,存盒，则采用程序降温法。（,4,冰箱,40min,，,-20,冰箱,30-60min,，,置于,-80,过夜，次日转入液氮。）,细胞的复苏,悬浮细胞和贴壁细胞的复苏方法一样，区别在于复苏后死细胞的清除方法。,复苏流程：,（,1,）取一支离心管，加入,3ml,的新鲜培养基备用。,（,2,）取出冻存的细胞，于,37,的温水中，,1min,之内迅速融化。,（,3,）迅速将解冻后的细胞加入预先准备好的离心管中，,1000,转,/,分钟，离,心,1,分钟。,（,4,）弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞5,）接种到培养皿（瓶）内，补足培养基，放入温箱培养。,补足培养基,放入温箱,重悬,3ml,新鲜培养基备用,1min,之内解冻,迅速倒入,细胞的复苏,复苏后死细胞的清除方法：,悬浮细胞：细胞复苏后，每,2,天按照,2:1,或,3:1,的比例传代一次，大约,1,周后，细胞生长,状态良好。,贴壁细胞：细胞复苏后,6h,（此时已有细胞贴壁），吸去培养基（含有大量死细胞），,重新加入新鲜培养基。,细胞复苏的注意事项,（,1,）细胞复苏原则：,快速融化（快融）。,（,2,）尽量减少室温下,DMSO,和细胞接触的时间。,预先准备好离心管并加入新鲜培养液；在,1,分钟之内,将细胞融化；,立,刻将融化后的细胞倒入离心管中。,（,3,）复苏时，离心时间不宜过长，,1,分钟即可，长时间离心会对细胞造成损伤，,降低细胞存活率。,（,4,）死亡的细胞应尽快清除掉，否则会影响存活细胞的状态。,（,5,）如果复苏不成功，更可能是因为冻存或保存过程中出现问题。,细胞污染时的处理,有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后,彻底消毒操作室,，复苏或重新购置细,胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。,（,1,）使用抗生素,污染后清除用药需采用大于常用量,5,10,倍的冲洗法，于加药后作用,24,48,小时，,再换常规培养液。此法在污染早期有效。,（,2,）加温处理,将污染的组织培养物放在,41,培养,18,小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。,所以在处理前要进行预试验，摸索能最大限度杀死支原体又对细胞影响最小的加热时,间。若先用药物处理后，再以,41,加温处理效果更佳。,其他注意事项,（,1,）细胞房要定期擦拭：包括地面、桌面、超净台等，先用自来水擦拭，再用消毒,液（,3,的来苏尔或者新洁尔灭,）擦拭，之后打开紫外灯，照射,2h,。,（,2,）细胞培养箱定期灭菌：将培养箱中的铁架取出，高压灭菌，箱内壁用,75%,酒精,擦拭，再用消毒液擦拭，紫外照射过夜。,（,3,）及时更换,CO,2,罐和,HEPA,过滤器，确保培养箱中有充足的无菌水。,（,4,）及时补充液氮，不可使细胞露出液氮表面。,（,5,）进入细胞房要更换无菌服，带好手套、口罩、鞋套等。,Thank You!,