细胞融合与单克隆抗体.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 细胞融合与单克隆抗体,山东师范大学生命科学学院,第一节 细胞融合概述,细胞融合（,cell fusion),，,又称体细胞杂交（,somatic,hybridiazation,），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程。,一、细胞融合的定义,Muller,于,1838,年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。,Virchow,于,1858,年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。,Luginbuhl,于,1873,年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。,Lange,于,1875,年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。,Cienkawski(1876),、,Buck(1877),、,Geddes(1880),在无脊椎动中发现了细胞合并现象。,1958,年日本学者冈田（,Okada,）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。,1974,年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（,PEG,）化学融合法。,1975,年,Kohler,和,Milstein,成功地融合了小鼠,B-,淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。,20,世纪,80,年代出现了电融合技术。,二、细胞融合研究进展,生物种类,细胞来源,成功年代,烟草两个种间,苷蓝,青菜,大豆,马唐草,矮牵牛,龙面花,大麦,花生,大麦,大豆,小麦,矮牵牛,油菜,大豆,玉米,大豆,大豆,野豌豆,大麦,蚕豆,大豆,草香木犀,酵母菌,鸡,大豆,烟草,大豆,秋水仙,人,胡萝卜,番茄,马铃薯,人,小鼠,叶,叶,叶,根,愈伤组织,叶,叶,花瓣,种子,种子,叶,悬浮细胞,叶,花瓣,叶,悬浮细胞,叶,悬浮细胞,悬浮细胞,悬浮细胞,叶,根,悬浮细胞,叶,原生质体,血红细胞,悬浮细胞,叶,悬浮细胞,叶,腹水癌细胞,原生质体,叶,根尖,纤维肉瘤细胞,畸胎瘤细胞,1972,1972,1972,1972,1972,1972,1972,1972,1972,1972,1972,1972,1972,1972,1972,1972,1972,1972,几种细胞融合成功的例子,植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞,动物细胞融合实验使用的小白鼠,三、动植物细胞的融合过程,植物细胞融合过程,人造小鼠培育过程示意图,四、细胞融合的意义,理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这,对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。,融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间,的遗传物质交换提供了有效途径。,体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分,裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体,DNA,亦可发生重组，从而产生新,的核外遗传系统。,淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。,第二节 细胞融合的基本原理,显微镜下细胞融合过程,融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,第三节 细胞融合的常用方法,一、仙台病毒法,仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：,两种细胞在一起培养，加入病毒，在,4,条件下病毒附着在细胞,膜上。并使两细胞相互凝聚；,在,37,中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需,要,Ca,2+,和,Mg,2+,，最适,PH,为,8.0,一,8.2,；,细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需,Ca2+,和,ATP,；,融合成巨大细胞，仍需,ATP,。,病毒促使细胞融合的主要步骤如下：,两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；,通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；,两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；,进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,优点是易得，用法简单，融合效果稳定。,聚乙二醇,(PEG),结构为：,HOH,2,C,（,CH,20,CH,2,）,n,CH,2,OH,，分子量大于,200,小于,6000,者均可用作细胞融合剂。,PEG,浓度以,W/W,；如将,10,克,PEG,与,10mlEagLe,氏液混合（假定,1ml,培养液为,1g,重,),，即成,50,PEG,溶液。,PEG,经高压灭菌后，与温热的,Engle,氏液混合。,通常用分子量低于,1000,的,PEG,作融合剂最好，,50,PEG,溶液能产生,最多杂交细胞。,PEG,溶液在,pH6.0,时细胞融合率最高。,二、聚乙二醇（,PEG,）法,聚乙二醇（,PEG,）法细胞融合过程,PEG,的作用机理,：,Kao,等认为，由于,PEG,分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成,H,键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，,PEG,能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。,PEG,诱导融合的特点,：,其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，,PEG,可能对细胞有毒害。,聚乙二醇（,PEG,）法,细胞融合步骤,（,1,）将两种不同亲本细胞各,5l0,6,混匀；,（,2,）离心沉淀，吸去上清液；,（,3,）加,1ml 50,PEG,溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触,1,分钟；,（,4,）加,9ml,培养液，离心沉淀，吸去上清液；,（,5,）加,5ml,培养液，分别接种,5,个直径,60mm,平皿，每个平皿加培养,液至,5ml,，,37,的CO,2,培养箱中培养。,（,6,）,624,小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。,三、电融合法,电融合法是,80,年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。,电融合法的优点：,融合率高、重复性强、对细胞伤害小；,装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；,免去,PEG,诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。,电融合的基本过程：,细胞膜的接触：,当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；,膜的击穿：,原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。,电融合诱导法原理示意图,第三节 杂种细胞的筛选,根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种类型：,异核细胞：非同源细胞的融合体。,同核细胞：两个相同细胞的融合体。,多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。,基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选,基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选,由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选,具有所需性状杂种细胞的筛选,常用的杂种细胞筛选方法,第四节 细胞杂交瘤技术与单克隆抗体,一、何谓单克隆抗体？,只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体,。,单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞,(,myeloma,cell),与经特定抗源免疫刺激的,B,淋巴细胞,(antigen stimulated B lymphoblast),融合得到杂交瘤细胞,(,hybridoma,cell),，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有,B,淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术,(,hybridoma,technology,）。,Niels,K.,Jerne,G.Kohler,C.Milstein,二、杂交瘤技术的基本原理,三、杂交瘤细胞的制备,（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基,骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体,选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（,HGPRT-,）,胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（,TK-,）,HAT,培养基,次黄嘌呤（,hypoxanthine,，,H,）,氨基喋呤（,aminopterin,，,A,）,胸腺嘧啶脱氧核苷（,thymidine,，,T,）,次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（,HGPRT-,）,胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（,TK-,）,（二）免疫小鼠,免疫程序是取,68,周龄,Balb,C,雌鼠，基础免疫,2,周，静脉再加强免疫一次，,35,天后用于融合。免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以,IgG,为例，第一次为,loo,g,，,第二次为,50,g,，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射,1l0,6,一,110,7,。,（三）脾细胞的制备,(1),引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；,(2),无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用,5ml,无血清培养液冲洗一次；,(3),把脾脏置于已消毒的,90,一,100,目不锈钢网或尼龙纱网中；,(4),在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，,令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入,3ml,无血清培养,液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可；,(5),把细胞悬液注入,50ml,离心管中，加,l0,一,20ml,培养液：轻轻吹打数次，室温中,置,5,分钟；,(6),离心,(800,一,1000,转分,),计数、备用。,（四）细胞准备,（,1,）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗,3,次,(37),，计数活力细胞,(,不少于,90,),；,（,2,）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗,3,次,(37),，并计细胞数和测定活力细胞；,（,3,）按,1,：,5,或,1,：,10,混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤 纸吸,净多余上清。,（五）细胞融合,(1),将,1ml 40,的,PEG,液一滴滴加入列细胞团中，在,60,秒内加完，同时并不断轻微,转动离心管或用手指轻弹离心管；,(2),在不断转动离心管中加,1ml,无血清培养液，,60,秒钟内加完；,(3),于,5,分钟内慢慢加完,20ml,无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感，,(4),离心,(800,转分，,8,分钟,),，去上清，用完全培养液,10ml,悬浮，轻轻混匀；,(5),取,96,孔板，每孔加,50,l,；,(6),取等体积细胞悬液，向另一,96,孔板中加,50P1,；,(7),送入,5,CO,2,，温箱中,37,培养，,24,小时后更换成,HAT,选择性培养掖。,（六）融合后细胞培养,(1),融合后,7,10天用,HAT,培养液半量换液,(,留一半旧的加一半新的,),后每隔,2,3,天,半量换液一次；,(2),两周后可改用,HA,培养液半量换液，或仍用,HAT,培养液；,(3)2,3,周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且透明；,(4),待集落增殖生长至,1,3,孔时，应进行抗体检测。,HAT,培养基,次黄嘌呤（,hypoxanthine,，,H,）,氨基喋呤（,aminopterin,，,A,）,胸腺嘧啶脱氧核苷（,thymidine,，,T,）,次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（,HGPRT-,）,胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（,TK-,）,（七）抗体检测,免疫荧光试验,放射免疫试验,(RIA),联免疫吸附试验,(ELISA),（八）单克隆抗体的大量制备,体内法,培养法,四、单克隆抗体的应用,单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病,诊断，以提高疾病诊断的准确性。,利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成,本，同时也增加了疫苗的安全性。,单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜,在技术。,单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不,断发展。,第五节 人源单克隆抗体,主要困难,（,1,）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力；,（,2,）获得抗原特异的人,B,淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获得抗原特异的,B,淋巴细胞的方法显然是不可行的；,（,3,）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。,本章小结,细胞融合又称体细胞杂交，是两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融,合形成单个细胞的过程。,细胞融合的方法主要有生物法（仙台病毒法）、化学法（聚乙二醇,法）和物理法（电融合法）。,杂合细胞的筛选方法主要有基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂,种筛选、基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选、由温度敏感型细胞,组成的杂种细胞的筛选及具有所需性状杂种细胞的筛选。,基于细胞融合的杂交瘤技术和单克隆抗体技术具有广泛的应用价值。,