细菌内毒素的简介.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,细菌内毒素检查法在药品和医疗器械检查中的应用,细菌内毒素检查,本讲座共分三部分,一、基础部分,二、标准部分,三、实验操作部分,一、基础部分,1.,前言,防止输注用药品及器械的热原污染，是临床上十分重要的。半个多世纪以来，热原检查法对保证注射用药品安全发挥了重要作用。但随着制药工业的发展，该方法已不完全适合许多品种的热原检查。为此，人们研究了一种替代热原检查法的方法，这就是我们今天正在研究和扩大应用的细菌内毒素检查法。细菌内毒素检查是输注药品及器械质量控制中的一项重要指标。,1.1,细菌内毒素检查法,1885,年美国的,W.H.Howell,发表了一篇有关鲎血的化学组成和凝集方面的研究成果，这可以说是鲎试验历史的开端。,1956,年，美国动物学家,F.Bang,发表论文,鲎的一种细菌性疾病,，阐明了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。,1964,年,F.Bang,和,J.Levin,提出了鲎血凝集的初步机理，,1968,年正式建立鲎试验（,Limulus,test,LT,),方法。,1980,年,USP20,版；,1987,年欧洲药典、,1989,年英国药典,1989,增补本、,1988,年日本药典第,11,增补本、,1993,年中国药典,1990,年版第二增补本开始收载细菌内毒素检查法。,1.2,细菌内毒素在我国的发展,在我国，,1975,年开始鲎试剂的研制，,1979,年开始将其用于放射性药品的细菌内毒素检查方法研究，,1983,年开始用于输液制剂热原检查的协作研究。,1988,年卫生部颁布细菌内毒素检查法，允许,4,种药品采用细菌内毒素检查法作为热原检查的初试方法；,1993,年中国药典,1990,年版第二增补本开始收载细菌内毒素检查法。,1995,年版中国药典规定,13,个品种进行细菌内毒素检查法。,2000,年版药典规定,60,个品种进行细菌内毒素检查法。,2005,年版药典规定,133,个品种进行细菌内毒素检查法。,2,有关术语及相关内容,2.1,热原反应,病人在静脉输注药剂后可能发生的发热、冷感、寒颤、恶心、呕吐、头痛、腰及四肢关节痛、肤色灰白、白细胞下降、血管通透性增强、昏迷、休克、死亡等一系列症状称为热原反应。,2.2,热原,所有能引起热原反应的物质称为热原。药品中的热原主要是细菌内毒素。一般可以认为：细菌内毒素是热原，但热原不等于细菌内毒素。,2.3,细菌内毒素检查法,2005,年版中国药典定义为：系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。,2.4,鲎试剂,我国生产的鲎试剂系鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，用于细菌内毒素检查。根据检查方法分为凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂；根据鲎试剂与内毒素反应的专一程度分为普通鲎试剂和特异性鲎试剂。特异性鲎试剂是专一对内毒素反应的鲎试剂。鲎试剂灵敏度用符号,表示，单位用,EU/ml,表示。,2.5,鲎,鲎是一种栖生于海洋的低等无脊椎动物，出现在古代泥盆纪，现存于世的有三属四种，常见的有两种，美洲鲎和东方鲎,2.6,细菌内毒素,是革兰氏阴性菌的细胞外壁层上的特有结构，即脂多糖，具有广泛的生物活性，以致热居首。其量值以国际单位（,IU),或内毒素单位（,EU),表示，现规定,1 IU=1 EU,。,2.7,细菌外毒素与细菌内毒素,细菌外毒素是一种由活菌合成并释放出来，对热敏感的蛋白质。,细菌内毒素是一种对热抵抗，且只有当菌体死亡裂解或人工破碎后方可释放来。,外毒素与内毒素的主要区别,区别要点,外毒素,内毒素,来源,G,+,、部分,G,-,G,-,存在不位,胞浆内合成分泌至菌体外,细胞壁成分,化学成分,蛋白质,脂多糖,稳定性,不稳定，,60-80,破坏,160-240,破坏,毒性作用,强，有选择性,弱,抗原性,强，可制成类毒素,弱,举例,肉毒毒素，白喉外毒素,大肠杆菌内毒素,内毒素的主要生物活性：,1,发热反应,2,白细胞反应,3,代谢性酸中毒,4,感染性休克,5,弥漫性血管内凝血（,DIC),2.8,细菌内毒素标准品,细菌内毒素标准品分为细菌内毒素国际标准品、国家标准品和工作标准品。,在我国，细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制得到的内毒素。,1996,年,WHO,建立第二批国际内毒素标准品（,94/580,，,10000IU,），规定,1IU=IEU,。,981,是用,IS2,为基准标定的我国第,6,批国家标准品，共生产,8,批。,细菌内毒素工作品分为冻干品和液体两种剂型，均可用于鲎试剂复核、干扰试验和实验中的阳性对照。,本品为一次性使用。,2.9,细菌内毒素检查用水,2005,年版中国药典规定细菌内毒素检查用水系指与灵敏度,0.015EU/ml,或更高灵敏度的鲎试剂,24h,不产生凝集反应的灭菌注射用水。,3,细菌内毒素的化学结构、量值和限值,3.1,化学结构,细菌内毒素的本质是脂多糖（,LPS),，主要有两部分组成：多糖和类脂,A,。多糖部分又可进一步分为,O-,特异性多糖链、核心寡聚糖。,O-,特异性脂多糖一般由,3-6,个单糖通过糖苷键相联形成低聚糖单位聚集而成，是,LPS,分子中最易变异的成分。,核心寡聚糖分为内核和外核。外核由数种己糖组成，内核含有庚糖特殊的酮糖，这部分结构对不同菌株的,LPS,基本相似。类脂,A,是,LPS,的毒性及生物活性中心。典型的类脂,A,含有一个以,1,，,6-,糖苷键相连的,D-,氨基葡萄糖双糖组成的基本骨架，双糖骨架的游离羟基及氨基可携带长链脂肪酸和磷酸基团。不同种属细菌合成的类脂,A,的分子组成及其骨架上的取代基团性质有差异。,3.2,细菌内毒素的量值,1996,年,WHO,建立第二批国际内毒素标准品,(94/580,，,10000IU),规定,1IU=1EU,。,我国国家标准品,981,是用,IS2,为基准标定的我国第,6,批国家标准品。每支含内毒素,9000EU,。,3.3,细菌内毒素的限值,供试品细菌内毒素限值按一下公式确定,L=K/M,，式中,L,为供试品内毒素限值，以,EU/ml,、,EU/mg,、,EU/U,表示。,K,为按给药途径，临床无任何不良反应的内毒素阈剂量，以,EU/kg,表示，注射剂,K=5EU/kg/hr,。,M,为人用最大剂量，以,ml/kg/,hr,mg/kg/hr,U/kg/hr,表示，中国人均体重按,60kg,计算。,4,中国药典,2005,年版细菌内毒素检查法的修订内容,中国药典,2005,年版较中国药典,2000,年版有重大修订，主要修订内容如下：,4.1.,定义改变：,2005,年版药典定义细菌内毒素检查法为利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。,4,中国药典,2005,年版细菌内毒素检查法的修订内容,2000,年版定义为：利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。,4.2.,把中国药典,2000,年版的细菌内毒素检查法应用指导原则，合并入附录,E,细菌内毒素检查法。,4.3.,明确了细菌内毒素检查有两种方法：凝胶法和光度测定法，供试品检测时，可用其中任意一种方法进行试验，只有当测定结果有争议时，以凝胶法结果为准。,4.4,细菌内毒素检查用水的要求提高，内毒素含量降到了,0.015EU/ml,，光度测定法用细菌内毒素检查用水的内毒素含量小于,0.005EU/ml,。,4.5,增加了供试品溶液的制备这一项，明确了供试品溶液的,PH,值在,6.08.0,范围内，配制酸、碱及缓冲盐的容器应去除内毒素，水用细菌内毒素检查用水。,4.6,鲎试剂灵敏度的定义有所改变,2000,年版的定义是：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度；,2005,年版的定义是：在本检查法规定的条件下使鲎试剂产生凝聚的最低内毒素浓度,4.7.,把原来的凝胶法细分为凝胶限量试验和凝胶半定量试验。,4.8.,凝胶限量试验中，阴性对照和阳性对照的平行管数都增加为,2,支。,4.9.,增加了凝胶半定量试验，通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。,4.10.,较详细讲述了光度测定法的方法。,二、标准部分,2.1,细菌内毒素检查法（中国药典,2005,年版）,2.2,医用输液、输血、注射器细菌内毒素检查法,GB/T14233.2-93,2.3,生物材料和医疗器材的细菌内毒素检查法,（卫生部药政局,1997,年药发,1997,第,81,号）,医用输液、输血、注射器细菌内毒素检查法生物材料和医疗器械的细菌内毒素检查法与中国药典,2005,年版的比较,法规,项目,医用输液、输血,注射器,BET,生物材料和,医疗器械,BET,中国药典,2005,年,BET,除热原,程序,玻璃器具,180,干烤,2h,获,250,30min,塑料器具,30%,双氧水,4h,，无热原水冲洗后,60,烘干。,250,至少,30,Min,或,180,至少,2h,也可用其他适宜的方法。,250,至少,1h,也可用其他适宜的方法，并应确证不干扰,BET,的检查,鲎试剂灵敏度复核,检测能出现阳性结果阴性结果的,4,个连续,2,倍等比稀释液，平行,4,管，,371,保温,602min,最高浓度的,4,管均为阳性，最低浓度的,4,管均为阴性。按公式计算,当,s,0.365,时按,=log-1(x/4),计算鲎试剂的灵敏度；,s0.365,时，测定无效。,检测,2.0,、,0.5,、,0.25,的内毒素平行,4,组，同时做,4,管阴性，最高浓度的,4,管均为阳性，最低浓度的,4,管均为阴性。,S,标准差,X 4,个连续内毒素稀释液最低阳性结果浓度的对数值。,检测,2.0,、,、,0.5,、,0.25,的内毒素平行,4,组，同时做,2,管阴性，最大浓度,2.0,的,4,管均为阳性，最低浓度,0.25,的,4,管均为阴性,NC,均为阴性,c,=lg,-1,(x/4),在,0.52.0,间有效,干扰试验,未涉及,比较鲎试剂在水中和样品中的灵敏度，各平行,4,组，结果,E,s,、,E,t,均应,0.52.0,之间，样品的稀释不大于,MVD,3,个批号,比较鲎试剂在水中和样品中的灵敏度，各平行,4,组，结果,E,s,、,E,t,均应,0.52.0,之间，样品的稀释不大于,MVD,3,个批号,2,个以上厂家的鲎试剂,检查法,供试品至少,3,个,浸提介质：内毒素含量,0.05EU/ml,输液器,10ml,输血器,15ml,反复荡洗,5,次后两端密闭，,37 2h,后合并,2,支,NC,2,支,PC,2,支供试品。,样品稀释到,MVD,，,1,支,NC,1,支,PC,1,支,PPC,2,支供试品。,样品稀释到,MVD,，,2,支,NC,2,支,PC,2,支,PPC,2,支供试品。,结果判断,PC,为阳性,NC,为阴性,样品均为阴性，合格,PC,为阳性,PPC,为阳性,NC,为阴性,样品均为阴性，合格,PC,为阳性,PPC,为阳性,NC,为阴性,样品均为阴性，合格,其他,鲎试剂灵敏度,0.25EU/ml,供试品细菌内毒素限量不超过,0.5EU/ml,样品溶液不稀释，当结果出现阳性时，,12,稀释，,4,支，,1,支阳，,无热原注射用水,0.05EU/ml,为浸提介质,细菌内毒素检查用水内毒素含量小于,0.015EU/ml,三、试验操作,1.,简述,1.1,鲎试剂灵敏度复核项的目的不仅是考察鲎试剂灵敏度和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确和试验条件是否符合规定。因此每个实验室再将一批新的鲎试剂用于试验前应进行鲎试剂灵敏度复核项试验。,1.2,干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制作用。,1.3,供试品检查时，阴性对照、阳性对照、和供试品阳性对照必须同时进行，否则结果无效。,2,试验材料及用具,天平、电热干燥箱（,180300,）、恒温水浴箱（,37 1,）、漩涡混合器、鲎试剂,(,应具有国家主管部门的批准文号）、细菌内毒素工作品、细菌内毒素检查用水；其他试验用具如移液枪、封口膜、一次性安剖等。,3.,凝胶实验技术,3.1,凝胶法的实验程序,1,试验准备：试剂、仪器及用具等,2,确定药品的细菌内毒素限值,L,3,选择鲎试剂的灵敏度,4,计算供试品的最大有效稀释倍数或最小有效浓度,5,鲎试剂灵敏度复核,6,药品与鲎试剂相容性的初筛试验,7,供试品干扰试验,8,干扰试验的验证,9,供试品日常的内毒素限量检查,3.2.,鲎试剂灵敏度复核,3.2.1,内毒素标准溶液的制备,取细菌内毒素国家标准品或国家工作标准品一支，用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，,75%,酒精棉球擦拭后开启，防止玻璃屑落入瓶内。按药典操作。例如使用细菌内毒素工作标准品（,150601-2005-10,，,100EU/ml),时的方法如下：,复溶：准确吸取细菌内毒素检查用水,1ml,假如瓶内，用封口膜将瓶口封严，置漩涡混合器上混合,15,分钟，即为,100EU/ml,。,稀释：取,0.2ml,内毒素标准溶液加入,1.8ml,细菌内毒素检查用水为,110,稀释液，即为,10EU/ml,内毒素标准溶液。,取,0.2ml 110,稀释液，加入,1.8ml,细菌内毒素检查用水,1100,稀释液即为,1EU/ml,内毒素标准溶液。,以后依次成倍稀释分别为,0.5EU/ml,，,0.25EU/ml,，,0.125EU/ml,，,0.0625EU/ml,，,0.03125EU/ml,。,在上述稀释过程中，每稀释一步，均需在漩涡混合器上混合,30,秒钟。,3.2.3,待复核鲎试剂按药典准备,例如：复核湛江博康海洋生物有限公司,TAL,（,0511090,0.125EU/ml,）反应结果,平行,管数,内毒素标准溶液浓度,NC,反应终点浓度,X,0.25,0.125,0.06,0.03,1,0.125,-0.903,2,0.125,-0.903,3,0.125,-0.903,4,0.06,-1.22,数据处理,c,=lg-1,（,X/4,）,=lg-1(-0.903)*3+(-1.22),=0.104EU/ml,结果判断,c,在,2.00.5,（,0.25EU/ml0.06EU/ml,）范围内，本批,TAL,的灵敏度标示值符合规定，应按标示值使用。,3.3,新品种细菌内毒素检查的实验设计方法,3.3.1,设计原理,凝胶法是将等体积的样品溶液和新配制的鲎试剂（各,0.1ml,）在试管中混匀,371,反应,602,分钟。如果检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其含有的内毒素浓度等于或大于鲎试剂灵敏度时，就会在试管中显示阳性反应，其机理为内毒素在钙、镁二价阳离子的参与下，首先激活鲎试剂凝固酶系统的,C,因子，最后将凝固蛋白原变成凝固蛋白。如果药品中存在阻碍或促进该反应的因素时，均会导致结果异常。当检测一个新品种时，须证明该样品本身是否存在这些因素，这就是通常说的干扰试验。当存在干扰因素时，为了排除干扰，最简单的方法就是对其进行适当的稀释。通过稀释，可以降低该样品中干扰成分的浓度。,3.3.2,干扰试验,干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。并且验证当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。,由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关，因此在干扰试验预试验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂，但建议使用较低灵敏度的鲎试剂，可尽量避免供试品所含内毒素对干扰试验造成的阳性影响。,3.3.2,内毒素限值（,L,）的确定,记录供试品名称、浓度,C,（干粉规格及溶解后浓度），最大人体剂量。例如：注射用盐酸阿糖胞苷（,05090801,，,0.1g/,支），最大剂量药品说明书给出为,3g/m,2,计算供试品限值,L=K/M,K=5EU/kg,人体表面积为,1.55m,2,，体重为,60kg,L=5/(3000*1.55/60)=0.065EU/mg,选择鲎试剂灵敏度,0.25EU/ml,计算供试品的最大有效稀释倍数,MVD=CL/,或最低有效浓度,MVC=/L=C/MVD,按市售鲎试剂的灵敏度,为,1.0EU/ml0.03EU/ml,稀释样品,取本品一支加细菌内毒素检查用水,2ml,溶解，按上述鲎试剂灵敏度范围样品依次稀释为,6.5,倍、,13,倍、,26,倍、,52,倍、,104,倍。,预试验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数。为正式干扰试验提供依据。,3.3.3,预试验,制备,NPC,稀释系列（不含内毒素的供试品稀释系列）,制备,PPC,稀释系列（含,2,内毒素的供试品稀释系列）确证,PPC,的有效性。,反应,TAL+NPC;TAL+PPC,每个浓度平行,2,管。,2 0.25 0.125 NC PC,PPC,NPC,以上结果确认，本品的最小不干扰稀释倍数为,13,倍。并且用灵敏度,0.25EU/ml,以上的鲎试剂检查,3.4,供试品干扰试验,3.4.1,试验程序,1,计算：供试品的内毒素限值,L=K/M,2,选择：鲎试剂灵敏度,3,计算：供试品的最大有效稀释倍数或最低有效浓度,4,根据初筛试验选择：供试品有效稀释倍数或有效浓度,5,制备：,2,、,、,0.5,、,0.25,内毒素水溶液,E,S,系列,2,、,、,0.5,、,0.25,内毒素供试品溶液,E,t,系列,6,反应：,TAL+BET,水（,NC,）,TAL+,供试品溶液（,NPC,），平行,2,管，,TAL+E,S,系列,TAL+E,t,系列，平行,4,管,7,结果判断：试验有效：,NC,管全部阴性（,-,），,NPC,全部阴性（,-,）,TAL+E,S,系列：,2,管全部阳性（,+,）,0.25,管全部阴性TAL+E,t,系列：,2,管全部阳性（,+,）,0.25,管全部阴性,8,数据处理：供试品在该浓度下无干扰,2.0ES0.5,，,2.0 Et0.5,若供试品在该浓度下有干扰，选择灵敏度更高的鲎试剂,3.5,供试品检查,1,日常检查包括,2,支供试品管，,2,支阴性对照，,2,支阳性对照，,2,支供试品阳性,2,检查程序,供试品：按,MVD,稀释供试品溶液,内毒素：,BET,水复溶稀释为,2,内毒素水溶液,供试品溶液复溶稀释为含,2,内毒素供试品溶液,3,鲎试剂：,BET,水复溶,供试品管,NC,PC,PPC,一、加样,0.1mlTAL,0.1ml,供试品溶液,0.1mlBET,水,0.1ml,2,内毒素水溶液,0.1ml2,内毒素供试品溶液,平行管数,2,2,2,2,二、封口、混合、孵育,371,。,602min,结果判断,合格,不合格,复试,试验无效,复试,3.6,供试品稀释举例,假设选择鲎试剂灵敏度为,0.25EU/ml,1,复方利多卡因注射液：,L=1.8EU/mg,规格,40mg/5ml,；,MVD=1.8/0.25=7.2,倍,稀释过程,0.5ml,（,8mg/ml,）,4ml 1mg/ml,（,1mg/ml,1ml,（,1mg/ml,）,3.6ml(3.6,倍,),1ml2ml(7.2,倍）,2.,注射用克林霉素磷酸酯：,L=0.21EU/mg,规格,0.3g/,支，加水,3ml,稀释,100mg/ml,MVD=100*021/025=84,倍,取,0.2ml 4.2ml(21,倍,),取,1ml4ml,（,84,倍）,结束语,随着内毒素研究工作的进展，细菌内毒素检查法应用范围越来越广，用于药品成品检查的品种越来越多。制药工业上更是日益显示出它的应用价值，该法用于药品生产过程检查，属于一种事前控制的制控手段，对提高药品质量，避免造成药品成批报废有重要意义。,在临床上检测机体内毒素可以作为一个衡量病情和判断预后的一个参考指标，也可用于指导临床治疗。,谢 谢 大 家,