试验出凝血检查.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验 出凝血检查,上海交通大学医学院,余文红,（一）血标本的采取应注意的问题,1.,PT、APTT,凝血实验检查均使用静脉血。采血人员应技术熟练，以防止组织损伤，外源性凝血因子进入针管。,2一般血液采集，进入容器至进行实验所用的时间越短，所分析的凝血因子被保护得越好。从输液三通管取出血的做法不可取。,3取血时病人应松驰，环境温暖，防止静脉挛缩，止血带的压力要尽可能小，取血时，拉针栓的速度要慢而均匀，使血液平稳地进入注射器，防止气泡的产生。,4一旦取样完毕，立即与抗凝剂充分混合，一般提倡使用真空采血管5用硅化玻璃或塑料注射器采血。考虑结果的精确性，应将试管刻度的可能误差控制在既定体积的10%以内。,6.采血后标本在低温保存且在一定时间范围内。,7.国际血液学标准化委员会（,ICSH）、,国际血栓与止血委员会（,ICTH）,推荐使用3.2,g/dl（,含2,H2O）,或0.109,mol/L,的枸橼酸钠作为凝血因子检查的抗凝剂。,8.抗凝剂在血标本的绝对含量可改变血浆中钙离子浓度，进而影响试验结果，因此应根据患者红细胞比例（,Hct,）,状况随时调整抗凝剂用量。,（二）应用试剂应注意的问题,1.组织凝血活酶工作制剂的国际敏感指数（,ISI），,为了使不同敏感性的组织凝血活酶在检测,PT,中能得到同样的结果，必须要制定一个共同的敏感性指标。,2.凝血活酶和部分活化凝血活酶的使用步骤必须严格按照说明书进行。通常在使用前必须充分混匀试剂，以使微粒重新均匀悬浮于液体中。,3.试剂准备过程中应该使用去离子水。,4.正常对照血浆通常将多份健康人血标本混在一起，以弥补个体误差。,（三）使用实验器材应注意的问题,1.玻璃器皿的要求：贮存和测试时应选用干净、没有划痕的试管。,2.温度的要求：人工测定终点法要求水浴箱的温度必须保持在（371），并且周围照明设备要好，便于读取终点。,（四）实验操作应注意的问题,1.许多试验误差都来源于技术的错误。在实验技术、试剂、温度及,pH,值上很微小的变化都会导致试验结果明显的变化。,2.手工法,PT,或试管法,CT,检查时，倾斜试管动作一定要轻，角度要小，以减少血液与管壁的接触面积。,3.血液凝固主要是酶催化的反应，所以实验过程中要严格控制理想的,pH,环境和溶液的离子强度。,4.试验结果准确还取决于所用的反应物的量、加入顺序和不同反应物的孵育时间。,5.,APTT、PT,需乏血小板血浆。,6.试验前检查血浆是否有溶血、黄疸、脂血和出现凝块。,7.报告方式：,以,PT,的秒（,s）,数报告。,以患者,PT（s）/,正常对照（,s）,的比（,PTR）,报告。,在口服药物治疗监控时以,INR,报告。,ICSH,规定，不再用百分比（活动度）报告。,APTT,以秒报告。,1987,年,WHO,提出,PT,值用,INR（international normalized ratio,国际标准化比值）作为,PT,结果报告形式，并用以作为抗凝治疗监护的指标。,INR=,病人,PT（s）/,正常人平均,PT（s）,ISI,PTR=,受检者,PT（s）/,正常对照,PT（s）,INR=PTR,ISI,ISI：,国际敏感指数（,international sensitivity index）11.9,CT、PT、APTT、,RT、Fg、TT,凝 血 时 间 测 定,C T,目的：掌握玻璃试管法凝血时间测定的方法,原理：,离体静脉血与玻璃表面接触后，血中,XII,因子活化并启动内源性凝血途径，最终生成纤维蛋白而使血液凝固所需的时间。,器材：,6,mm,直径玻璃试管3支,静脉采血器材,37恒温浴箱,秒表,步骤：3支试管各1,ml,血，每隔0.5,min,倾斜，第一管计时后，立即观察第二、三管并计时，直至血液凝固。,结果判断：从血液刚进入注射器至第3管凝固所需时间即为凝血时间。,正常参考值：412分钟,报告方式：,CT,X.Xmin,（,玻璃试管法,）,注意事项：,试管应洁净干燥，抽血应“一针见血”且血液中不含泡沫。,温度恒定为37，倾斜试管角度应在30左右,。,评价：,凝血时间曾用玻片法测定，但由于毛细血管采血，易混入组织液而使凝血时间正常，属于淘汰方法。,延长：严重内源性凝血途径凝血因子有缺陷；血中抗凝物质增多；肝素治疗,缩短：高凝状态（,DIC,早期）,凝 血 酶 原 时 间,P T,原理：,在乏血小板血浆中加入组织因子和钙离子（钙凝血活酶）后，血浆发生凝固的时间即为凝血酶原时间（,PT）。,步骤：,取空腹静脉血1.8,ml,加入含有0.2,ml109mmol/L,枸橼酸钠的试管中混匀备用。,抗凝血以3000,r/min,离心10,min,分离血浆,将试剂、正常人混合血浆、待测血浆与37预热5,min。,血浆0.1,ml,加入混匀的试剂0.2,ml，,开动秒表计时。,正常参考值：,PT：1113,秒,PTR：10.15,INR：0.81.5,报告方式：,PT：X.Xs，,正常人血浆,X.Xs,PTR：X.X,INR：X.X,注意事项：,试管应洁净干燥，抽血应“一针见血”，抗凝剂与血液比例（1：9）应准确。取血后4,h,内完成测定。,钙凝血活酶必须标有国际敏感指数（,ISI），ISI,越接近于1.0越敏感。,标本测定前应先测定正常人混合血浆，其,PT,值在允许范围内才能测定样本。,评价：,血浆凝血酶原是一种筛选试验，是用来证实先天性或获得性纤维蛋白原、凝血酶原和凝血因子,V、VII、X,的缺陷或相应抑制物的存在，也用于监测口服抗凝治疗时引起的凝血酶原和因子,VII、X,水平的下降。,实质：,对检测样本（血浆）中存在凝血激酶时的再钙化反应，这种过程包括了因子,VIIa,、,组织因子、磷脂、钙离子对凝血酶原的活化，凝血酶裂解纤维蛋白原和纤维蛋白单体的聚集交联。,活化部分凝血活酶时间测定,APTT,原理：,用白陶土激活,XII,因子、脑磷脂代替血小板磷脂，测定乏血小板血浆加入,Ca2,+,后凝固所需时间。,步骤：,采血 空腹静脉血1.8,ml+0.2ml 109mmol/L,枸橼酸钠混匀。,分离血浆 3000,r/min,离心10分钟分离血浆。,溶解试剂 临用时加1,ml,蒸馏水，室温静置15,min,以上，混匀后使用。,预温活化 0.1,ml,血浆+,APTT,试剂0.1,ml,混匀，37准确孵育3,min（,其间轻轻摇动数次）,加钙计时 加入0.1,ml 25mmol/L CaCl2,混匀并立即开动秒表计时，20,s,后，观察混合液流动状态,。,正常参考值：一般在33.6840.32,s（,不同仪器和试剂所测之参考值有差别）,报告方式：,APTT：XX.Xs，,正常人血浆：,XX.Xs,注意事项：,采血时穿刺尽量一针见血，不要淤血和气泡，采血后立即与抗凝剂混合，尽快送往实验室。使用枸橼酸盐（抗凝）血浆,如果不能立即测试，应尽快分离血浆，盛血浆的容器加塞，防止,PH,值改变,血浆在28下保留7天,钙凝血活酶必须标有国际敏感指数（,ISI），ISI,越接近于1.0越敏感。,临床意义：,APTT,延长：,表明有内源性凝血途径有关因子的缺陷（血友病）和纤维蛋白原缺乏。,纤维活力增加，如继发性，原发性纤溶以及血循环中有纤维蛋白（原）降解产物（,FDP）。,血循环中有抗凝物质。,APTT,缩短：,高凝状态，如,DIC,的高凝期，促凝物质进入血液以及凝血因子的活性增高等。,评价：,APTT,和,PT,同时检测是目前二期止血缺陷的主要筛选试验组合。,在有临床出血症状的前提下：,APTT PT,提示,正常 延长 因子,VII,的缺陷,延长 正常 因子,VIII、IX、XI,缺陷,正常 正常 怀疑因子,XIII,缺陷可能,延长 延长 除因子,II、V、I、X,缺陷,外，主要是异常抗凝物质,的增多,血浆复钙时间RT,原理：,在去钙离子的抗凝血浆中，重新加入适量的钙后，血浆发生凝固。,步骤：,0.2,ml 0.1mol/L,草酸钠+静脉血1.8,ml,混匀，离心分离血浆。,0.1,ml,血浆置37水浴中，+0.025,mol/L CaCl2 0.1ml，,立即开动秒表记录时间。,正常参考值：,2.080.49分（2.183.77分钟）,注意事项：,不要溶血，否则时间缩短,CaCl,2,新鲜配制,分离血浆以1000转/分为宜，高速离心可使大量血小板下沉而导致复钙时间延长。,复钙交叉时间,RT,步骤：,按下列比例准备5份待测血浆：,加样量 1 2 3 4 5,受检血浆（,ml）0.01 0.05 0.09 0.10,正常血浆（,ml）0.10 0.09 0.05 0.01 ,上述试管，置37 1,min，,加0.025,mol/LCaCl2 0.1ml，,混匀后，记录血浆凝固时间。,注意事项：,所用血浆均为富含血小板血浆，分离出血浆后需在2,h,内检测完毕。,临床意义：,RT,最早作为内源性凝血系统相关凝血因子缺陷的筛选检查，但由于这个试验不如,APTT，,又容易受血小板数量和功能影响，目前只用来筛选是否存在病理性抗凝物质增多。,延长的复钙时间如被1/10量的正常血浆所纠正，则表示受检血浆中缺乏内源凝血因子；如不被少量正常血浆纠正，提示存在异常抗凝物质。,血浆纤维蛋白原,Fg,纤维蛋白原的测定方法众多，大体上分三大类：,基于经加凝血酶后，形成纤维蛋白的方法，即可凝固蛋白法。,物理、化学测定法。,免疫学测定法。,目的和原理,为了解凝血途径最后环节的状况，排除纤维蛋白原减少、异常对凝血筛选试验的影响，了解纤溶活动度等可选择本试验。,Clauss,法以凝血酶作用于受检血浆中的纤维蛋白原，使其形成纤维蛋白，血液凝固。,纤维蛋白原的量与凝固时间成负相关，检测结果与参比血浆制成的标准曲线对比可得出纤维蛋白原的含量。,步骤：,将参比血浆用血浆稀释液作原倍、1：2、1：4、1：8、1：16稀释5管。,取稀释血浆0.2,ml,于小试管中，置37水浴预热2分钟，再加凝血酶溶液0.1,ml，,记录时间相关分析：,首先先清除内存。,INV,+,AC,，,浓度（,log,或,In）,XD，YD,输入（如不取对数，浓度直接输入,XD，YD,读取值,DATA,输入；全部数据输入完毕，按,INV,+,9,读出相关系数,r。,待测读数,INV,+,log,或,In,读出相关浓度。,如不取对数，待测读数直接,INV,+,x,读出相关浓度。,最终浓度需根据样品稀释倍数乘积。,标准曲线：,t（s）,25,20,15,10,5,0,0.5 1 1.5 2 2.5C（g/L）,如血浆纤维蛋白原含量大于4,g/L,时，应稀释血浆后重测，结果乘以稀释倍数。低于0.8,g/L,时，需将原血浆改为12或15稀释，在标准曲线上查得结果后，除以5或除以2。,正常参考值：,24,mg/ml,临床意义：,纤维蛋白原增高除生理情况下的应激反应、妊娠后期外，主要出现感染、灼伤、动脉粥样硬化、急性心肌梗死、多发性骨髓瘤、糖尿病、败血症等。,纤维蛋白原减少见于,DIC、,原发性纤溶亢进症、重症肝炎、肝硬化和溶栓治疗时。,评价：,Clauss,方法测定的是纤维蛋白原功能，因此需纤维蛋白原结构正常，且有一定的含量，对低（无）纤维蛋白原血症和因此后纤维蛋白原血症应改用,ELISA,和,RIA,等免疫检测手段。,主要误差来源：,血浆稀释不准。,凝血酶活性不足或失效。凝血酶一般应在低温保存，稀释后在塑料(聚乙烯)试管中，置4可保存活性24小时。,测定终点观察不准确，尤其是纤维蛋白原含量高时，往往很快即凝固，手工法重复性较差，不易做准。,血浆凝血酶时间,TT,原理,以标准凝血酶溶液加入受检血浆，使凝血酶裂解血浆中的纤维蛋白原，形成纤维蛋白，造成血浆凝固，此时所需时间为凝血酶时间。,方法：,0.1,ml,血浆+0.1,mlTT,试剂，37水浴中观察凝固时间。,正常参考值：,1618,S,评价：,时间大于正常参考值3秒：,DIC、,肝脏病变。,TT,时间缩短，并不代表高凝状态或,DIC,前期，是技术原因。如操作失误，组织液混入血标本，标本在4环境中放置过久。,