特异性微小RNA-19a抑制剂对胃癌细胞增殖影响系列.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,特异性微小RNA-19a抑制剂,对,胃癌细胞增殖的影响,一、立 项 依 据,(,一,),胃癌概述,1.,胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。,2.,全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位,.,3.,早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，病变已属晚期。,4.,胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿瘤标志物如,CEA,灵敏度仅,40%,，使肿瘤常常发生浸润转移,5.,肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正常细胞伤害较大，亟需高特异性的肿瘤药物,(,二,),微小,RNA,1.,已有报道显示，微小,RNA,与胃癌的发生发展有着密切的关系。,2.,微小,RNA,分子,(micro RNA,miRNA),是非编码的,RNA,分子,(noncoding RNA,ncRNA),对真核细胞的基因表达、细胞发育分化和个体发育等多方面起调控作用。,3.MicroRNA,的主要功能是调节与个体生长、发育、疾病发生过程相关基因的表达,在生物发育过程中发挥着包括早期发育、细胞分化、细胞凋亡、,肿瘤,生成等多方面的重要作用,研究,miRNA,的表达,尤其对其功能研究,对探索生物进化及防治人类疾病具有重要意义。,(,三,),胃癌组织中微小,RNA,的表达谱,芯片分析胃癌组织中异常表达的微小,RNA,Guo J,et al.J Gastroenterol Hepatol.,2009,24(4):652-657,19,种差异表达的微小,RNA,12,7,miR-139-5p,，,miR-497,和,miR-768-3p,首次在非肿瘤组织中发现,miR-340*,、,miR-421,和,miR-658,首次在癌组织中发现高表达,二、研究目标,microRNA-19a,胃癌细胞,microRNA-19a,？,microRNA-19a抑制剂,本课题主要研究特异性,微小,RNA-19a,的抑制剂对胃癌细胞增殖的影响，从而为胃癌的治疗提供新的靶点。,初步假设：特异性,微小,RNA-19a,的抑制剂抑制胃癌细胞的增殖。,三、研究内容,设计并合成微小,RNA-19a,的,2-,甲氧修饰的,RNA,寡核苷酸（微小,RNA,抑制剂），用脂质体转染到,SGC-7901,和,MGC-803,胃癌细胞，然后用实时定量逆转录,-,聚合酶链反应技术检测微小,RNA-19a,的表达情况，最后用,MTT,法检测胃癌细胞的增殖情况。,四、可行性分析,微小,RNA,的抑制剂由生物公司合成并购买,细胞转染实验以及,MTT,法技术都已普及,实时定量,-PCR,基础二楼生化教研室可进行本实验,五、研究方案设计,材料,胃癌细胞,SGC-7901,和,MGC-803,（购于上海生化所细胞库）,DMEM,培养液（,4,C,保存）,胎牛血清,RNA,提取,Trizol,法试剂,转染,Lipofectamine 2000,试剂,实时定量逆转录,-,聚合酶链反应试剂盒,通用逆转录引物,针对微小,RNA-19a,而设计,PCR,扩增的引物,微小,RNA,抑制剂：抑制微小,RNA-19a,活性的,2-,甲氧修饰的,RNA,寡核苷酸,方法,1,、细胞培养 胃癌,SGC-7901,和,MGC-803,细胞在,37,度、含,5%CO2,的培养箱中培养。,DMEM,培养液中含有,10%,小牛血清。选择对数生长期细胞用于实验。,2,、细胞转染 转染前,1d,选择生长状态良好的细胞胃癌细胞，以,3105cells/well,的密度接种,6,孔板，待细胞密度达到,50%-70%,后，用,lipofectamine 2000,转染试剂按转染试剂盒说明书转染，培养,4,小时后新鲜培养液。,3,、细胞总,RNA,提取及实时定量,RT-PCR,检测微小,RNA,的表达水平 用,Trizol,试剂提取细胞内总,RNA,并测定,RNA,浓度，逆转录成,cDNA,，再按说明书进行实时定量,PCR,，以,U6,作为小,RNA,含量的参照。,PCR,反应条件为：先,95,度,15min,热启动，然后按,94,度,15s,、,60,度,30s,、,72,度,30s,，共,40,个循环。最后通过解链曲线分析扩增产物的特异性。微小,RNA,的相对表达量用 方法来表示，,4,、,MTT,法检测胃癌细胞增殖情况 以,1.5,104cells/well,接种胃癌细胞于,96,孔板，先观察脂质体转染试剂对照组、微小,RNA,抑制剂阴性对照组和空白对照组,3,组间细胞生长差异，在确定前,2,组对细胞的生长没有明显影响的情况下进行一下实验。用,3,个不同浓度（,0.50mol/L0.7mol/L1.00mol/L,）的微小,RNA,抑制剂转染细胞，每组设,3,个复孔。,48h,后,492nm,和,630nm,双波长下检测吸光度（,A,）值，每组取均值计算细胞抑制率。,5,、统计学处理 数据用,SPSS13.0,软件分析，两组间均数比较用独立样本,t,检测，结果用均数,标准差（,Xs,）表示。,六、预期研究成果,特异性,微小,RNA-19a,的抑制剂抑制了胃癌细胞当中微小,RNA-19a,的表达，抑制了胃癌细胞的增殖。,七、经费预算,胃癌细胞SGC-7901和MGC-803（购于上海生化所细胞库）,两种试剂盒（购于生物公司）,总费用约,58,00元,八、参考文献,Tony Bou Kheir,Ewa Futoma-Kazmierczak,Anders Jacobsen Anders Krogh,Linda Bardram,：,miR-449 inhibits cell proliferation and is down-regulated in gastric cancer,Zhang Chun-zhi,Han Lei,Zhang An-ling,Fu Yan-chao,Yue Xiao,Wang Guang-xiu,Jia Zhi-fan1,Pu Pei-yu,：,RMeseiacrcrho arRticNleA-221 and microRNA-222 regulate gastric carcinoma cell proliferation and radioresistance by targeting PTEN,蒋振，郭俊明，肖丙秀：特异性微小,RNA,抑制剂对胃癌细胞增殖的影响,Thank You！,