二细菌的生长繁殖消毒与灭菌.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细菌感染的检测,实验二 细菌的生长繁殖、消毒与灭菌,一、讨论：,1,、消毒灭菌的方法、实验室生物安全,2,、细菌的人工培养：培养基、细菌培养技术、细菌生长现象,二、示教：,1,、消毒灭菌的常用方法,2,、药敏实验,3,、培养基制备、种类、用途,4,、细菌生长现象观察,三、操作：细菌的接种（液体、半固体、固体培养基）,(,一）消毒灭菌方法、实验室生物安全,1.,常用术语,消毒,(disinfection),：,利用理化因素杀死物体或环境中病原微生物的措施。并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物,灭菌,(sterilization),：,利用理化因素杀死物体上所有微生物的过程，包括芽胞。,无菌操作（,aseptic technique),：,防止细菌进入人体或其他物品的操作技术。,（,2,）常用方法,物理,消毒灭菌法,：,热力灭菌法,：,干热灭菌法,、,湿热灭菌法,辐射杀菌法：电离辐射,-X,、,、,射线,非电离辐射,-,紫外线、日光、微波,滤过除菌法：滤过除菌法,干燥低温抑菌法：抑菌和灭菌,化学,消毒灭菌法,：,生物,消毒灭菌法,热力灭菌法,干热灭菌,焚烧、烧灼、红外线,干烤（,160170/2h,）,热力灭菌法,湿热灭菌,巴氏消毒法：,6230min,或,72 30sec,煮沸法,30min,流动蒸气消毒法,间歇蒸气灭菌法,高压蒸气灭菌法：,121,1.05Kg/cm,2,(15,个大气压,),20min,辐射杀菌法,电离辐射：,X,、,、,射线,原理,:,通过产生,OH,、,O,2,等活性游离基进行杀菌；通过破坏,DNA,的结构导致菌体死亡,非电离辐射：,紫外线,、微波、超声波、日光,辐射杀菌法,：非电离辐射,.,紫外线：,200,300nm,日光,(,最佳：,265,266nm),原理：导致,DNA,分子构型改变,DNA,复制出现差错,用途：只用于空气和物品表面的消毒（注意防护）,.,微波：细菌体内的蛋白质、核酸等分子在微波场下高速旋转、振动，细菌蛋白质凝固、核酸变性而死亡。,常用于对非金属器械的消毒，优点是无污染而且迅速。,.,超声波是指频率大于,20kHz,的声波，其频率高，波长短，定向性好，穿透力强。,原理：空化作用,用途：液体或可放置液体中不影响其性能的物品,滤过除菌法,贝克菲滤器,蔡氏滤器,玻璃滤器,膜滤器,孔径,0.22um-0.45um,除菌,空气过滤器,:,无菌棉花、活性炭及细玻璃纤维等,可对空气进行过滤除菌,2,、化学消毒灭菌法,常用消毒剂,(disinfectants),的杀菌机制,使菌体蛋白变性或凝固,干扰微生物酶系统和影响其代谢,损伤细胞壁、细胞膜,环氧乙烷消毒设备,医学上常用消毒剂类型作用机制及种类,类别,作用机制,常用种类,酚类,蛋白变性细胞膜损伤,石炭酸,醇类,蛋白变性,乙醇,氧化剂,氧化、蛋白沉淀,高锰酸钾、过氧乙酸、碘酒,重金属盐,氧化、蛋白酶变性,红汞、硫柳汞,表面活性剂,蛋白变性，细胞膜损伤,新洁而灭,染料,干扰氧化、抑制繁殖,龙胆紫,酸碱类,破坏膜、壁，蛋白凝固,醋酸、生石灰,烷化剂,蛋白质、核酸烷基化,环氧乙烷,醛类,与氨基结合,蛋白变性,甲醛、戊二醛,化学消毒灭菌法,高效消,毒剂,high-level,中效消毒,剂,intermediate-level,低效消毒剂,low-level,可杀死包括细菌芽胞在内所有微生物,不能杀死芽胞，可杀死细菌繁殖体、真菌、大多数病毒,可杀死大多数细菌繁殖体，对真菌、病毒杀灭力弱,1.,含氯消毒剂,2,.,过氧化物消毒剂,3,.,醛类消毒剂,4,.,环氧乙烷,1,.,含碘消毒剂,2,.,醇类消毒剂,1.,季铵盐类,2,.,氯已定,3,.,高锰酸钾,医疗器械物品的消毒灭菌,高危器械物品,需进入无菌组织的物品。,所有这些物品都应该灭菌,。,中危器械物品,不进入无菌组织但接触黏膜的器械。,采用消毒即可,。,低危器械物品,只接触未损伤皮肤,但,不进入无菌组织和不接触黏膜的物品。,一般用后清洗、消毒即可。,快速周转的医疗器械,室内空气消毒灭菌,a.,物理消毒法,紫外线照射（,1.5,W,/m,3,，1h,）最常用,；,滤过除菌,：,空气通过孔径小于,0.2,m,的高效过滤装置以除去细菌和带菌尘埃,b,化学消毒法,包括化学消毒剂喷雾和熏蒸,过氧乙酸喷雾、熏蒸,；,过氧化氢喷雾,；,二氧化氯溶液,喷洒；,中草药点燃烟熏,手和皮肤的消毒,用肥皂和流动水经常并正确洗手,病原微生物污染时应用消毒剂消毒,消毒灭菌的方法,热力灭菌法,辐射杀菌法,滤过除菌法,干燥与低温抑菌法,干热灭菌法,湿热灭菌法,物理消毒灭菌法,化学消毒灭菌法,高效消毒剂,中效消毒剂,低效消毒剂,3,、实验室生物安全,生物安全（biosafety）是生物技术安全的简称,狭义,的,指现代生物技术的研究、开发、应用及转基因生物可能对生物多样性、生态环境和人类健康产生潜在的危害。,广义,的,指与生物有关的各种因素,对社会、经济、人类健康及生态,环境所产生的危害或潜在风险。,（,1,）生物安全的内容,转基因生物、外来入侵物种、环境污染,病原微生物（感染性疾病、人畜共患疾病、动物疾病、食源性疾病、医院感染）,实验室泄漏：,生物武器、生物恐怖,遗传资源保护,合成生物技术,转基因及其它新型生物技术,事故引发的,生物危害,是由进行病原体研究、教学、诊断、治疗、生物制品研发和生产等机构的事故导致病原体,泄漏,，引发了传染病暴发的生物灾害。这类生物灾害往往影响较大，危害范围小，造成局部灾害大，持续短,1979,年，苏联国防微生物与病毒研究所炭疽芽孢干粉制剂车间的加压系统爆炸，约,10,公斤芽孢粉剂泄漏，造成斯维尔德洛夫斯克城数百人伤亡。,2003,年,9,月新加坡国立卫生研究院,BSL,3,实验室发生研究人员感染,SRAS,病毒的事故。,2003,年,12,月我国台湾省一实验室也发生了研究人员感染,SRAS,病毒的事故，,2004,年,4,月我国国家,CDC,的专业实验室发生了,SARS,的实验室人员感染。,（,2,）如何实现实验室生物安全？,加强管理，规范行为，消除隐患，确保安全,如何管？,依法、规范管理,管那些？,病原微生物、实验室设立、,风险评估、实验活动、实验,装备、废弃物、人员,类 别,根据传染性、感染后对个体或者群体的危害程度，,第一类,能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物,。,第,二,类,能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。,第,三,类,能够引起人或动物疾病，但一般情况下对人、动物或环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物,第,四,类,在通常情况下不会引起人或动物疾病的微生物。如小鼠白血病病毒等,病原微生物分类管理,病,原微生物实验室的,分级管理,（二）细菌的人工培养：,培养基的概念、种类、用途,细菌培养技术,细菌生长现象,1.,培,养,基的概念、种类、用途、制备,培,养基,（,culture medium),:,是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品,。,基,础培养基,增,菌培养基,选,择培养基,鉴,别培养基,厌,氧培,养基,根据物理性状：,液体、固态、半固体,根据用途,牛肉膏,3.0g,蛋白胨,10.0g,氯化氯化钠（,NaCL,）,5.0g,磷酸二氢钾（,KH2PO4,）,1.0g,琼脂,15.0g,蒸馏水,1000mL,混匀，加热溶解，调,PH,至,7.6,分装，,112kPa,高压灭菌,15min,，冷却至,45,倾注灭菌平板。,普通琼脂平板制备,2.,细菌的,培养,方法,分离培养：划线接种在固体培养基的表面，因划线的分散作用，使许多原混杂的细菌在固体培养基表面上散开。,纯培养：挑取一个菌落，移种到另一培养基中，可生长出来的大量的纯种细菌。,发酵培养：在适宜的条件下，发酵罐中大量培养微生物（细菌、真菌等）细胞和生产代谢产物的工艺过程。,分离培养,：,纯培养,(pure culture),液体,培养基,斜面,培养基,菌落,(colony),纯培养：,菌种,筛选,摇瓶试验,发酵罐,中试验,发酵培养,由实验室研究到产业化的过程,发酵生产,3,.,培养基中生长现象：液体培养基,菌膜生长,沉淀生长,混浊生长,混浊,：,大多数细菌,沉淀,：,链状生长的细菌,菌膜,：,专性需氧菌,，,如结核杆菌、枯草杆菌,。,有鞭毛的细菌,：试管中沿穿刺线呈羽毛状或云雾状混浊生长；平皿中迁徙样生长,无鞭毛细菌：沿穿刺线线状生长或无扩散生长现象,用于细菌的动力试验,无动力,有动力,迁徙生长,3,.,培养基中生长现象：,半固体培养基,菌落,colony,：,在固体培养基上，,一般经,18,24,小时培养后，单个细菌即可繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团。,不同细菌菌落在大小、形状、颜色、气味、透明度、表面光滑,/,粗糙、湿润,/,干燥、边缘整齐、溶血性不同,3,.,培养基中生长现象：,固体培养基,细菌的菌落一般可分为三种,：,光滑型菌落,(smooth colony,，,S,型菌落）,：新分离的细菌大多呈光滑型菌落，表面光滑、湿润、边缘整齐。,粗糙型菌落,(rough colony,，,R型菌落）：,菌落表面粗糙、干燥、呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐。,黏液型菌落（,mucoid,colony,，,M,型菌落）：,菌落黏稠、有光泽，似水珠样。细菌多有厚荚膜或丰富粘液层。,粗,糙,型,菌,落,黏,液,型,菌,落,光,滑,型,菌,落,水溶性色素（如铜绿假单胞菌）,脂溶性色素（如金黄色葡萄球菌）,铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌,4.,人工培养细菌的用途,医学,感染性疾病的病原学诊断,细菌学研究,生物制品的制备,工农业生产,基因工程中应用,二、示教：,1,、消毒灭菌的常用方法,:,物理,-,热力（干、湿热各两个）过滤器（,3-4,种）、冰箱、紫外线（两个）、超生波,化学,-,高、中、低效消毒剂各类型,2-3,个代表；,2,、药敏实验：纸片法,3,、培养基的种类：见前解释、观察实物,4,、细菌生长现象观察：见前、观察实物,药敏实验：纸片法,Zone Interpretive Criteria(mm),Drug,Disk content(ug),Res,Int,Susc,cefazolin,30,14,15-17,18,gentamicin,10,12,13-14,15,三、操作：细菌的接种培养,液体培养基 固体斜面培养基 半固体培养基,固体平皿培养基,1.,固体平皿培养基分离接种方法,右手执笔式握持接种环，在酒精灯火焰上烧灼接种环，待冷，取待测菌液一环。,左手抓握琼脂培养基平皿，用手掌将平皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬起一些，进行接种。,持接种环在琼脂表面的,1,区涂布，划线时接种环与琼脂表面呈,30,40,的角度轻轻接触，利用腕力，切忌划破琼脂表面。,烧灼接种环，待冷后，将接种环在,2,区、,3,区划线数次，各线条间隔要小，但不能重叠。,划完,3,区不需烧灼接种环，在,4,区作连续划线，如此反复至划完整个平皿（如图,3,）。,图,1,接种环的握持方法,图,2,平皿的握持方法,1,区,4,区,3,区,2,区,图,3,划线分离的方法 左：分区 右：培养后的结果,接种完毕，盖好平皿盖，在平皿底玻璃上用记号笔注明标本名称、接种时间、接种者等。,然后将平皿的底朝上，放置在,37,孵箱内孵育,24h,。,取出后观察琼脂表面的菌落分布情况，注意观察最后,1,2,区内是否分离出单个菌落，并观察记录菌落特征（如菌落大小、形状、透明度、色素等情况）。,2.,固体斜面培养基接种方法,3.,半固体培养基接种方法,右手持接种针，灭菌冷却,以接种针挑取菌种垂直刺入半固体培养基的中心，,然后循原路退出。,半固体琼脂培养基穿刺接种：主要是观察细菌有无动力。,4.,液体培养基接种方法,挑取少量菌苔或菌液，伸入待接种的培养基管内，在接近液面的管壁上轻轻研磨，并沾取少许培养液调和，使菌混合于其中,【,思考题,】,一、细菌的生长繁殖与人工培养在医疗实践中有何意义？,二、临床常用化学消毒剂的种类、作用机制与用途？,三、以实验小组为单位，预习化脓性球菌分离鉴定并设计“化脓性球菌分离鉴定”方案（要求小组长切实负责，小组成员分工进行文献及相关资料查阅收集、最后归纳总结。）,