神经细胞体外培养方法及应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,神经细胞体外培养方法及应用,田东萍,汕大医学院病理教研室,神经细胞体外培养的历史,神经组织的体外培养方法是由,Harrison，,于1907年首创的。,由于该方法具有简化细胞生化环境、明确生长条件、便于施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。,九十余年来，这项技术已从组织块（或植块）培养（,explant,culture）,发展到分离细胞培养(,dissociated cell culture)，,并逐渐与多种现代技术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用。,组织块培养分离细胞培养甚至单一型细胞培养,神经组织的植块培养法,悬滴培养方法,单盖玻方法,双盖玻方法 1925,改良双盖玻方法,培养物：,CNS,灰质、白质、外周神经节或神经小段,突起 非神经元外伸,优点,所需培养液量少，可反应组织代谢中,微量生化改变,保留了植块内组织特征,不足,培养空间小，,O,2,CO,2,供少,培养空间湿度难以控制，水分会蒸发,密封手续繁杂，不利更换培养液，难,以观察单个神经元生长。,神经元的分离细胞培养方法,1956年，,Nakai,首创了神经组织的分离培养方法,材料来源：胚胎动物神经组织,神经元增殖发生于胚胎期,形态学分化和化学分化程度低，体外存活强，成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤。,部位：,灰质、,PNS,神经节，神经元集中，密度大,神经元的体外培养液,天然合成成分 血清 血浆 胚胎撮液,人工培养基,无血清培养基 化学限定性培养基,常用的：,DMEM+,添加剂,F,12,葡萄糖 为神经元能量代谢主要来源 33,mm,CO,2,NaHCO,3,缓冲系统重要,HEPESO,2,耗量更高,K,+,神经元生理活动的重要离子，,K,+,是神经元存活所必需的，,K,+,24.5mM,能提高神经元存活，促分化,非神经元成分的抑制 有 2-3天,神经元无血清限定培养液,人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基本营养物质和无机盐类，但仍无法满足不同类型细胞的特殊需要。大多数神经元在基础培养液中即使能够存活也为期不长，更难以分裂。因此可根据神经元的特性，给基础培养中再添加某些特殊物质。,选择添加剂的基本过程,限定连续细胞系的体外生长条件。,试定该细胞系来源的细胞的培养,液条件,。,Bottenstein,实验室经过长期研究发现如下添加剂比较好,人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺加入到,F,12,与,DMEM 1:1,混液中，可以代替血清添加物，用来培养大鼠,CNS,的成神经细胞瘤细胞。删去其中任何一种添加物都可导致成神经细胞瘤细胞生长状况锐减。该实验室共列出了三种神经元限定性培养添加物的配方，代号分别为,N,1,、N,2,、N,3,。,N,1,的配方为,胰岛素5,g/ml,转铁蛋白5,g/ml,孕酮20,nM,腐胺100,Um,硒30,nM,神经体外培养的生长基质,胶 元,多聚赖氨酸,LN,神经细胞培养操作程序表,脊髓后根节 大脑皮质,孕1820天大鼠胚胎 新生13天大鼠,在,CMF-Hanks,液中取出组织除去脑膜,与,CMF-Hanks,液一起移至离心管,舍弃,CMF-Hanks,液，再加入5,ml 0.25%,胰蛋白酶和5滴0.2%,Dnase,液,37,0,C，30min,舍弃胰蛋白酶，加入5,ml,培养液和10滴,Dnase,液,用巴斯德吸管吹打20次，再用套有微量加样器头的加样器吹打20次,若有组织残渣，将上清移至新试管再加3,ml,培养液反复吹打,将细胞悬液收集于离心管，离心1200,r/min，8min，,舍去上清，向沉淀加培养液，离心1200,r/min，8min,加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为110,7,种入涂有,poly-D-lysine,的盖片上，每片50,l,放入,CO,2,孵箱中过夜,次日加3,ml,培养液,2天后（培养的第三天）换入有,DNA,合成阴断剂的培养液,神经元的分离培养过程,大鼠大脑皮层神经组织细胞培养,组织来源,新生大鼠1-2日龄，碘 酒，洒精消毒。,断头，取出大脑，分离脑 膜，夹取两侧大脑皮质放入接种培养液中，用,D-Hanks,冲洗二遍。,剪碎，0.5-1,mm,3,用,D-Hanks,充分洗去残血,加入5-10倍量0.25%胰蛋白酶，移入离心管中放到水37,0,C,浴箱中消化20-25分钟。,终止消化离心洗涤 2000转/分，5分钟弃上清。吹打制成细胞悬液。,台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的24孔板中。,37,0,C 5%CO,2,培养2天后换生长培养液,大鼠海马神经细胞培养方法,神经元体外生长特征,接种密度与体外存活率,当96孔 每孔2000-3000个 或 7000-10000个/,cm,2,几乎无神经元存活,当8000-12000个/96孔 或 2.8万-4万个/,cm,2,存活率最大。,3天后不到接种的一半，故研究某一生长因子前3天加药最好,神经元的体外存活时间,短1-2,W,长 4个月,体外分化标志,破伤风毒素,NSE,NF200,NF160,神经细胞的特殊染色鉴定方法,尼氏体染色,焦油紫,甲苯胺蓝 硫瑾等组化染色,镀银染色,NADPH-d,特异性神经组织化学法,神经细胞培养的应用,应用领域,研究各种因素对神经的影响,1.化学物质，物理因素，生物因素，环境中化学因子，,自由基，外伤、高温等因素，病毒感染。,2.药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，如,中药，脑活素，神经生长因子，成纤维细胞生长因子,（,bFGF,），,神经营养因子,3.细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等。,4.各种生理病理状态下神经元状态改变实验方法,研究手段及测量指标,1.形态学观察：,光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触,电镜：超微结构。,2.激光共聚焦扫描显微镜（,laser,confocal,scanning microscope,LCSM)：,研究细胞内成分变化，离子改变等，三维重建,3.膜片钳技术，细胞表面通道和离子流动，电变化。,研究手段及测量指标,4.聚丙烯酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化,5.染色：苏木素-伊红（,HE）,染色及尼氏（,Nissl,),染色，免疫组化染色。,6.显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起长度及胞径。,7.荧光光度分析仪：,MTT,法测定细胞的,OD,值,培养神经细胞的观察和鉴定,1.神经细胞培养存活的标志：种植24小时后贴壁，渐长出几十微米的突起，神经细胞大多都能存活。,2.特殊培养阶段：培养的,9到12,天之间，有较多神经元死亡，以后存活下的细胞突起长而多，互相形成网络，电镜下可见突触。,3.,形态学观察：神经细胞胞体大，饱满，核大，有立体感，折光性强，周围有一圈光晕，轴突细长均匀，直径恒定。,研究范围,细胞凋亡,细胞生长状态,存活率,膜流动性,基因产物表达,细胞内酶活性,细胞内离子含量变化,细胞表面受体，等等,放映完毕,请多指教,