细胞融合-与-单克隆抗体.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,细胞融合 与 单克隆抗体,Cell Fusion and Monoclonal Antibodies,4.1,细胞融合,4.2,杂种细胞的遗传特性和应用,4.3,淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体技术,4.1,细胞融合,4.11,聚乙二醇介导的细胞融合,4.12,细胞电融合,4.13,杂种细胞的筛选,4.1,细胞融合,定义,：指用自然或人工方法、使两个或更多个不同的细胞融合成一个细胞的过程，又称为体细胞杂交,4.11,聚乙二醇（,PEG,）介导的细胞融合,原理：,PEG,带有大量的负电荷,和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下，形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高,pH,高钙离子的溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的,PEG,分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。,影响因素：,分子量：,400,6000,（通常：,1000,4000,）,浓度：,20,60%,（通常：,30,50%,）,时间：悬浮法,1,2 min,离心法,5,8 min,pH,：偏碱为宜（,pH7.4,8.0,）,其他：二甲亚砜、植物血凝素,4.12,细胞电融合,原理：,悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在,1,100MHz,和,100,1000V/cm,的交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子，而沿电场方向发生,双向电泳,，此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲，即可使相邻细胞膜的接触区产生,可逆电降解,，从而触发细胞融合。,双向电泳：,在交流电场的作用下（,1MHz,，,150V/cm,）细胞膜上正负电荷分离，产生偶极，两个极化的细胞会发生相互的紧密接触。,可逆电降解：,在高频电场的脉冲作用下（,50ms,，电场强度,1.2,2kV/cm,），细胞膜上的离子发生位移，而使电荷分开，细胞质膜产生电势，正、负电荷相互吸引，细胞膜变薄，随细胞势的增加，膜降解穿孔，形成微孔。,电场诱发的微孔面积和数目与细胞膜总表面积相对不大时，微孔可以重新封闭。,电场示意图,甜菜原生质体电融合过程,1,）在高频电流电场下的相互接触。,2,）脉冲刺激后,30s,3)50,秒后,4,）,1.5,分钟后,5,）,6,分钟后,6,）,15,分钟后，原生质体融合完成。,注意事项,1,）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质。,2,）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。,优点：,融合率高，达,70,80,，甚至,100,融合率（融合组多核细胞的核数对照组多核细胞的核数,/,对照组的全部细胞数）,100,可在显微镜下定向诱导细胞融合,可直接挑选杂种细胞,4.13,杂种细胞的筛选,原理：,两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。,1,）亲本,2,）,同核体：,同源原生质体的融合体,3,）,异核体,：非同源的原生质体的融合体,4,）,多核体：,含有双亲不同比例核物质的融合体,5,）,异胞质体,：具有不同胞质来源的杂合细胞。,6,）,核质体,：有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体,植物细胞筛选方式,1,）,遗传互补筛选法：,利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。,如亲本,1,：叶绿体缺陷型,亲本,2,：光致死型,两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白,色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长,2,）,抗性互补筛选法：,利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。,如：,亲本,1,：对放线菌素,D,抗性，但在,MS,培养基上不能超过,50,个世代,亲本,2,：对放线菌素,D,很敏感，但能在,MS,上生长,杂种细胞能在含有放线菌素的,MS,培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡,3,）,利用物理特性筛选法：,根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。,亲本,1,：用异硫氰酸荧光素染色原生质体,亲本,2,：叶肉细胞原生质体,在荧光显微镜下，亲本,1,为红色，亲本,2,为绿色，杂种细胞可以区分,4,）,利用生长特性筛选法：,利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。,例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。,动物细胞的筛选方式：,1,）,利用抗药性筛选系统,：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。,亲本,A,：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感,亲本,B,：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感,杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长,2,）,营养互补筛选系统：,细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。,亲本,A,：色氨酸缺陷型,亲本,B苏氨酸缺陷型,杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。,3,）,温度敏感突变型,杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在,32,度到,40,度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。,亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在,37,度左右生长。,亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。,杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。,4.2,杂种细胞的遗传特性和应用,4.21,杂种细胞在细胞生物学研究,中的应用,4.23,杂种细胞在植物育种中的应用,4.21,杂种细胞在细胞生物学研究中的应用,1,）,基因定位,不同种属的细胞融合时，常会出现一个亲本细胞的染色体被优先排除，而另一个亲本的染色体被选择性留下，即,染色体分离,的现象。由此，可根据表型和与表型特征相对应的基因在特定染色体上。,例如：,HGPRT,人细胞与,TK,的小鼠细胞融合后，可用,HAT,培养基分离得到一种仅含一条人,E,组染色体的杂种细胞，具有,TK,活性，由此得到人的,TK,基因是在,E,组染色体上的。,2,）,体细胞杂种的致瘤性分析,通过正常二倍体细胞和致瘤性或病毒转化细胞的融合来进行致瘤性的遗传分析。,3,）,遗传缺陷的基因互补,基于杂种细胞的基因互补作用，可分为基因间和基因内的互补作用，即杂种细胞可以具有两种亲本在遗传上缺陷的基因表型。通过这种基因互补，可以用正常基因来治疗由于基因突变或基因缺失的疾病。,4,）,分化功能表达调控的研究,通过细胞融合可将不同分化状态或组织类型的细胞构建成为能够存活的种内或种间杂种，同时对杂种细胞内的基因组和胞质观察和分析，了解如何通过相互作用而最终导致原先表达的分化性状熄灭或保留。,4.22,杂种细胞在植物育种中的应用,杂种细胞,是一条,新的育种途径,，可以产生新经济性状的良种。,科学家已经在禾本科、茄科、豆科、十字花科等植物中得到了杂种再生植株。,一些近亲植物、有性不亲和的组合，如马铃薯,番茄等都得到了再生植株。,目标：地上和地下部兼用种、固氮禾等,具有两种不同优势性状的新品种,。,4.3,单克隆抗体,4.31抗体的结构与功能,4.32,单克隆抗体的制备和生产,4.34,单克隆抗体的改造和应用,4.31,抗体的结构与功能,抗体,是由,B,细胞受抗原刺激后所分泌的蛋白质。,抗体分子：,由四条肽链所组成，两条重链（,H,链）两条轻链（,L,链）。,结 合 区：抗体分子上有两个抗原结合区,可变区（,V,区）,稳定区（,C,区）,人体内的五种抗体,4.32,单克隆抗体的制备,单克隆抗体,(monoclonal antibody,，简称,McAb),：将能够产生抗体的,B,淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种,单一类型,的,只针对某一特定抗原决定簇,的,抗体分子,，就是单克隆抗体。,单抗的制备过程,动物免疫与亲本细胞的选择,细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备,杂交瘤细胞的筛选：有限稀释法等,单克隆抗体的制备和冻存,单克隆抗体的纯化,亲本细胞的选择,骨髓瘤细胞：,一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续继代培养，且为,HPRT,或,TK,。多用,BALB/C,小鼠的骨髓瘤细胞。,淋巴细胞：,经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。,免疫方法：体内法或体外法。,体内法：,对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。,3,4,天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在,95,以上的可以用于融合。,体外法：,直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为,10,7,个,/ml,，加适当浓度抗原，,3,4,天后，收集被刺激的淋巴细胞。,细胞融合,将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以,2,：,1,或,10,：,1,的比例混匀于,50ml,锥形离心管内，,1200rpm,离心,7,10,分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻振摇离心管边在,60,秒钟内逐滴加入,50%,的,PEG 0.5ml,，随后静置,90,秒，再于,5,分钟内边振摇边逐滴加入,5,10ml,不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止,PEG,的作用，再静置,10,分钟。,HAT,培养基筛选杂交瘤细胞,细胞团块分散后，加,HAT,溶液,，稀释至骨髓瘤细胞不超过,2,10,5,ml,，即可加入有饲养细胞的,96,孔塑料培养板内每孔,0.1ml,，如是,24,孔板，每孔,0.5ml,；总量分别为,0.2ml,和,1ml,。,用,HAT,选择性培养时每隔,2,3,天半量换液，,7,天后可以选择出杂交瘤细胞。,细胞融合的选择示意图,HAT,选择系统,HAT,是含一定浓度,次黄嘌呤（,H,）,、,氨基喋呤（,A,）,及,胸腺嘧啶核苷（,T,）,的一种,选择性培养基,，其中三种成分与细胞,DNA,合成有关。,DNA,合成途径有两种。,杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（,HPRT,-,）,骨髓瘤细胞或,胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（,TK,-,）,骨髓瘤细胞为亲本之一。,HPRT,-,细胞的嘌呤只能由,全合成途径,产生；,TK,-,细胞的嘧啶只能由,全合成途径,合成。,含氨基喋呤培养基,抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。,嘌呤合成通路的阻断,淋巴细胞具有合成,DNA,的两条途径。,杂种细胞通过互补作用获得,HRPT,或,TK,基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过,补救合成途径,合成,DNA,。,在,HAT,培养基中，,HPRT,-,或,TK,-,亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有,杂种细胞存活,。,特异性杂交瘤细胞的筛选,通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞，仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。可取上清液，根据,抗原的性质、抗体类型及所需灵敏度,等具体情况来加以选择。,可溶性抗原,可采用放射免疫、免疫酶标测定、间接血凝等方法测定。,细胞抗原,可采用免疫荧光、,51,Cr,释放试验、溶血空斑测定、补体依赖的细胞毒等方法直接测定针对这些抗原的抗体。,利用培养基对单抗进行鉴定的过程,杂交瘤细胞的克隆化培养,利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。,在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的,饲养细胞,，如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等。,方法有,有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪,等。,有限稀释法,通过适当的稀释达到分离,单个细胞,进行培养的目的,1,）取出阳性孔内的细胞进行计数,2,）用培液将其稀释到例如每毫升内,10,个细胞。,3,）如果在,96,孔板内每孔加,0.1ml,，其机率将为每孔内落入一个细胞。,4,）加入一定数量的饲养细胞，经过,8,12,天后，可观察到有集落生长的孔。,5,）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。,软琼脂培养法,在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层,0.5,的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的,0.25,的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞的,96,孔板内。,单抗的大规模生产,1,）,诱生腹水,将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于,Balb/c,小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。,方法是将降植烷或石蜡油注入,Balb/c,小鼠腹腔，,0.5ml/,只，,7,天后腹腔接种,35,10,6,杂交瘤细胞。,1020,天后即可抽取腹水，每毫升腹水中约含,110mg,单抗。,2,）利用,微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维培养系统,等进行大规模培养。,4.33,单克隆抗体的改造和应用,单抗作为体内体外,诊断试剂,在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等,单克隆抗体靶向制剂，治疗癌症等疾病,杂交人鼠单克隆抗体,单抗作为体内体外诊断试剂,现在已经有各种不同类型的单抗试剂合在市场出售，例如乙型肝炎的表面抗原，铁蛋白、促绒毛膜性激素、促甲状腺激素、癌症、艾滋病等诊断试剂。,用,同位素标记的单抗,在特定的组织中成象的技术可以用于肿瘤、心血管畸形的,体内诊断,。,1,、单克隆抗体靶向制剂,1,）药物与单抗,直接偶联,通过化学反应使药物分子的氨基与抗体分子的羧基之间直接形成稳定的酰胺键。,利用氧化剂把药物分子上的糖基氧化成羰基。,利用羰基与抗体分子的氨基反应形成西佛氏碱，最后还原。,这样的靶向制剂保留一定的药物活性，并具有一定的选择性。,如：,1,，,4,溴柔红霉素与肿瘤细胞单抗形成的偶合物，对肿瘤有明显的选择性毒性。,2,）药物,通过小分子,与单抗连接,通过一些小,分子交联剂,，把药物分子上的某些基团连接起来。,小分子交联剂：如,同型双功能试剂,，包括戊二醛、顺乌头酸酐、马来酸酐、戊二酐；,异型双功能试剂,：,N,琥珀酰胺基,3,丙酸和寡肽等。,顺乌头酸酐制成的最常用，在中性条件下较稳定，在酸性条件下容易发生水解。这种靶向试剂与肿瘤的表面抗原结合后，会进入溶酶体，在酸性环境下释放药物，而杀死肿瘤细胞。,3,）药物通过,大分子,与抗体相连,大分子聚合物：葡聚糖、多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等。,总之，利用单抗试剂合可以作为靶向药物，针对肿瘤、自身免疫系统疾病、各种病原体病等。,2,、杂交人鼠单克隆抗体,鼠源抗体一般无法有效地激发宿主的免疫防卫系统，还可能引发人对鼠源抗体本身的免疫反应。,在抗体中，,Fc,片段,在抗体中的作用是激活机体免疫反应。,对鼠源抗体进行改造，利用人源的,Fc,区域的,DNA,片段替换鼠源单抗的,Fc,的,DNA,片段。,嵌合抗体可以保留其目标专一性，降低人的抗鼠反应。,一种制备人肿瘤单克隆抗体的方案,3,、人源单克隆抗体,方法,1,：分离人,B,细胞，使之与荧光标记的抗原相结合，通过荧光标记选择能产生特殊抗体的,B,细胞，并用,Epstein,Barr,病毒转化，得到少量的单抗。,方法,2,：将人源免疫干细胞导入缺失大部分免疫细胞的小鼠体内，遇到抗原时，产生人源的抗体。,方法,3,：将改造过的人的抗体基因导入鼠胚胎中，能在免疫后得到产生人抗体的转基因鼠,4,、抗体融合蛋白,将抗体的可变区与一非抗体蛋白融合起来，使融合蛋白继承有抗体分子的结合特异性。可以保留不同程度的,抗体结合特异性,和,激发其他免疫反应的能力,。,5,、抗体酶,一种对酶促反应过渡态特异的抗体结合了酶与抗体的优点，既可以起,酶促催化作用,，又可以,起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用,。,制备抗体酶的方法：,1,）利用与过渡态结构相类似的半抗原通过杂交瘤技术生产抗体酶。,2,）利用定向催化，即利用抗体的特异性和亲和性使催化反应的两种底物按一定的构象结合并定向，从而降低底物分子的自由度，反应速度加快。,3,）对抗体进行化学修饰，使抗体与催化基团相连。,6,、单链抗体,在大肠杆菌的系统中，可以表达,VL,衔接物,VH,的序列，产生单链抗体。,单链,F,V,片段,:,抗体体积小、免疫原性较低，渗透性好，用于实体肿瘤的诊断和治疗。,生物导弹,：利用单链抗体序列接上一段药物蛋白的编码序列，表达后的蛋白可以根据抗原抗体反应，而达到专一性治疗疾病的目的。,双功能抗体片段：,两个抗原结合特异性不同的,Fab,或,Fv,片段通过二硫键连接起来，如一个结合肿瘤特异性抗原，一个结合杀伤性,T,细胞，这样识别和消灭肿瘤细胞的功能可以统一在一个单链抗体分子上。,参考书目,现代生物技术导论,瞿礼嘉 等,高等教育出版社,细胞工程,焦瑞身等,化学工业出版社,动物细胞工程原理与实践,冯伯森等,科学出版社,生物工程,李继珩,中国医药科技出版社,本章结束,谢谢！,