血清总胆红素及结合胆红素测定.ppt

血清总胆红素及结合胆红素测定,重氮反应法测定总胆红素和结合胆红素,【,实验原理,】,血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，产生偶氮胆红素；非结合胆红素须有加速剂咖啡因,-,苯甲酸钠,-,醋酸钠作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮试剂反应，也产生偶氮胆红素。本法重氮反应,pH6.5,，最后加入碱性酒石酸钠使紫色偶氮胆红素,(,吸收峰,530nm),转变成蓝色偶氮胆红素，在,600nm,波长比色，使检测灵敏度提高。,【,检验原理,】,总胆红素在,pH3.0,附近，在钒酸盐和表面活性剂存在下，可以被氧化成胆绿素。与此同时，胆红素特有的黄色也随之消失。测定胆红素氧化前后吸光度的差，可以计算出样品中总胆红素的浓度。,【,试剂,】,1,咖啡因,-,苯甲酸钠试剂,2,碱性酒石酸钠溶液,3,72.5mmol/L,亚硝酸钠溶液,4,28.9mmol/L,对氨基苯磺酸溶液,5,重氮试剂,6,5.0g/L,叠氮钠溶液。,7,胆红素标准液,【,操作步骤,】,1.,样品的测定 取,3,支试管，按下表程序操作,.,混匀后，波长,600nm,，对照管调零，读取吸光度，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。,2.,标准曲线制作,取,5,支试管，分别编号，然后按表稀释胆红素储存液配制胆红素标准液。,混匀,(,不可产生气泡,),，按总胆红素测定法操作。每一浓度作,3,个平行管，并分别做标准对照管，用各自的标准对照管调零，读取标准管的吸光度。配制标准液用的溶剂血清中尚有少量胆红素，同样测定后得一吸光度值。每个标准管的吸光度值均应减去此吸光度，然后与相应胆红素浓度绘制标准曲线,【,参考范围,】,血清总胆红素：,5.1,19mol/L(0.3,1.1mg/dl),；,血清结合胆红素：,1.7,6.8mol/L(0.1,0.4mg/dl),。,【,临床意义,】,1,血清总胆红素测定的意义,(1),有无黄疸及黄疸程度的鉴别。,(2),肝细胞损害程度和预后的判断 胆红素浓度明显升高反映有严重的肝细胞损害。但某些疾病如胆汁淤积型肝炎时，尽管肝细胞受累较轻，血清胆红素却可升高。,(3),新生儿溶血症 血清胆红素有助于了解疾病严重程度。,(4),再生障碍性贫血及数种继发性贫血,(,主要见于癌或慢性肾炎引起,),，血清总胆红素减少。,2,血清结合胆红素测定的意义 结合胆红素与总胆红素的比值可用于鉴别黄疸类型。,(1),比值,20%,溶血性黄疸，阵发性血红蛋白尿，恶性贫血，红细胞增多症等。,(2),比值,40%,60%,肝细胞性黄疸。,(3),比值,60%,阻塞性黄疸。,但以上几类黄疸，尤其是,(2),、,(3),类之间有重叠。,【,临床意义,】,谁是动名词？,doing,胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素,【,原理,】,胆红素呈黄色，在,450nm,附近有最大吸收峰。胆红素氧化酶,(BOD),催化胆红素氧化，随着胆红素被氧化，,A450nm,下降，下降程度与胆红素被氧化的量相关。在,pH8.0,条件下，未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，因而检测,450nm,吸光度的下降值可反映总胆红素含量；加入,SDS,及胆酸钠等阴离子表面活性剂可促进其氧化。,在,pH3.7,4.5,缓冲液中，,BOD,催化单葡萄糖醛酸胆红素,(,mBc,),、双葡萄糖醛酸胆红素,(,dBc,),及大部分,胆红素氧化，非结合胆红素,(Bu),在此,pH,条件下不被氧化。用配制于人血清中的二牛磺酸胆红素,(,ditaurobilirubin,，,DTB),作标准品，检测此条件下,450nm,吸光度的下降值可反映结合胆红素的含量。,【,试剂,】,1,0.1mol/LTris-HCl,缓冲液,(pH8.2),称取三羟甲基氨基甲烷,(Tris)1.211g,，胆酸钠,172.3mg,十二烷基硫酸钠,(SDS)432.6mg,，溶于去离子水,90ml,中，在室温,(25,30),用,1mol/L,盐酸调节,pH,至,8.2(,约用,6ml),，再加蒸馏水至,100ml,，置冰箱保存，此液含,4mmol/L,胆酸钠、,15mmol/L SDS,。,2,0.2mol/L,磷酸盐缓冲液,(pH4.5),。,3,BOD,溶液,如系冻干品，按说明书要求复溶，但复溶后冰箱保存不宜过长,(,约可保存,1,周,),，如系液体,(,可能含有甘油,),置,4,冰箱可保存较长时间，,BOD,贮存溶液的酶活性一般在数千至,1,万,2,万,U/L,，,BOD,工作液酶活性可按反应液中,BOD,终浓度达,0.3,1.0U/ml,计算。,4,总胆红素标准液,(342mol/L),按胆红素测定,J-G,法中方法配制，或市售合乎要求的标准液。,5,结合胆红素标准液,将,DTB,配于胆红素浓度可忽略不计的人血清中，或用冻干品按说明书要求重建。配制后分装于聚丙烯管内，,70,保存，可稳定,6,个月。冻干品未重建前置低温中，至少稳定,1,年。,【,操作步骤,】,总胆红素和结合胆红素测定分别按表标准管进行。取,4,支试管，标明标准空白管，测定空白管，标准管和测定管。,加入,BOD,工作液后立即混匀，置,37C,水浴,5min,，用分光光度计，在,450nm,波长，去离子水调零，读取各管吸光度,(A),。用于对照管的比色杯与非对照管的比色杯不得混用。,谢谢,