免疫原和抗血清的制备概要.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,免疫原和抗血清的制备,第一节免疫原的制备,免疫原是能够引起机体产生抗体，并能与之发生反应的物质,一、颗粒性抗原的制备：,1.,颗粒抗原指细胞抗原或细菌抗原。,2.,细菌抗原：,H,抗原有动力的菌株,O,抗原,100,2-2.5h,为了 破坏,H,抗原，获得,O,抗原,Vi,抗原,3,.,虫卵、细胞膜颗粒抗原呈乳浊状，多用,V,内免疫，较少用佐剂作皮内注射,二、可溶性抗原的制备：,组织和细胞粗抗原的制备：,1.,组织和细胞混合抗原的制备：组织匀浆制备：标本要求：新鲜或低温（,-40,）保存的去除表面包膜或结缔组织或一些大血管，脏器应进行灌注，除去血管内残留血液,制备,处理好组织,0.05,NaN3,生理盐水洗净,剪成小块粉碎,高速组织捣碎机法,2000-3000rpm,离心,10min,研磨法：玻璃匀浆器,乳钵研磨,上清,10000-20000rpm 20-30min,高速离心,2.,细胞抗原的制备：,细胞抗原细胞膜蛋白抗原细胞浆抗原细胞核及核膜抗原粉碎：（,1,）反复冻融法（,2,）冷热交替法：适合细菌，病毒蛋白质及核酸（,3,）超声破碎法：适合于微生物和组织细胞 细菌，尤其真菌厚膜孢子难破坏（,4,）自溶法：利用组织和微生物的自身酶系需一定,PH,和温度动物组织,cell,0-4,微生物室温（,5,）溶菌酶法：一定,PH,（,PH8.0,），溶菌酶可专一破坏菌胞。蜗牛酶，纤维素酶消化细菌和组织,cell,（,6,）表面活性剂处理法,蛋白质抗原的制备和纯化：,可溶性抗原绝大部分为蛋白质,1,.,超速离心和梯度密度离心法：用来分离亚细胞部分及大分子蛋白质,1,）差速离心：高低速交替进行。将大分子物质分离,2,）梯度密度离心：区带分离法，通过梯度密度来维持重力的稳定性，通常分离的悬液中的颗粒比液体重，要使之上浮，必须加入第三种成份，其密度连续或不连续升高，即所谓梯度,3,）第三种成份多用甘油、蔗糖氯化色，氯化铷适合于少部分大分子抗原，对于大量的中、小分子量的蛋白质抗原不适用此法,2.,选择性沉淀法：,用沉淀剂或改变某些条件促使抗原成分沉淀,1,）核酸除去法：（,1,）提取沉淀剂：（,2,）核糖核酸酶降解法：用,DNA,或,RNA,酶与提取液作用,30-60min,（,4,），即可除去核酸,2,）盐析沉淀法：（,1,）抗原的粗筛,33-50,饱和度的硫酸铵（,2,）提取丙种球蛋白主要为,IgG,33-40,饱和度的硫酸铵（,3,）抗原的浓缩,3,）有机溶剂沉淀法：有机溶剂多为酒精和丙酮,4,）水溶性非离子型聚合物沉淀法：,PEG+,蛋白质颗粒,沉淀、复合物、蛋白质发生水的重分配分子量,2000-6000PEG,可用于沉淀蛋白,PEG,浓度不同可沉淀不同,pro3-4,沉淀免疫复合物,6-7,沉淀,IgM,8-12,沉淀,IgG,12-15%,沉淀其他球蛋白,25,沉淀白蛋白,3.,凝胶过滤和离子交换层析：,1,）分析筛层析又名凝胶过滤，将,Ag,分成大、中、小三种大分子较快出来，小分子因被阻留，出来较慢。根据分子量不同,2,）离子交换层析：离用带离子基因的纤维素流动相逐步增加离子强度，蛋白质按电荷不同或量的差异分组常用,DEAE,纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）根据,pro,携带电荷不同（溶液中等电点不同）常用于分离,IgM,因为,IgM,分子量大凝胶过滤洗脱曲线,4.,亲和层析：,利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间的具有的专一性亲和力而设计的层析技术eg,：,Ag,和,Ab,，酶和酶的抑制剂，酶蛋白和辅酶，激素和激素受体等其之间有特殊亲和力，可紧密结合成复合物,.1,）亲和层析支持物的选择：常用：琼脂糖珠（,Sepharose,2B,、,4B,、,6B,）,2,）配体的选择：,3,）抗原或抗体与支持物的结合：步骤：（,1,）活化支持物上的功能基因溴化氛,PH11,与支持物上的羟基形成氨基形成氨基甲酸酯基因（,2,）交联（联接）（,3,）清洗：除去未结合的,pro,（,4,）亲和层析条件的选择：,原理：一定条件下，,Ag,和,Ab,能可逆性地结合成复合物，当条件改变（如稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体固定在不溶性的载体上能从液相中专一性分出抗体或抗原。,根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方法偶联到不溶性载体上，当将相应的抗血清（或抗原）按层析方法加入柱中，抗血清中的相应的抗体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随洗脱液流出。再改变缓冲液的,PH,值和离子强度，则可以使抗体和偶联在载体上的,Ag,解离（加入解脱剂），经洗脱，从而得到纯化的,Ab,。,2,）配体的选择：,抗原或抗体与支持物的结合：步骤：（,1,）活化支持物上的功能基团,溴化氰,PH11,与支持物上的羟基形成氨基甲酸酯基团（,2,）交联（联接）（,3,）清洗：除去未结合的,pro,（,4,）亲和层析条件的选择：,原理：在一定条件下Ag,和,Ab,能可逆性地结合成复合物，当条件改变（如稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体固定在不溶性的载体上就能从液相中专一性地分出抗体或抗原。根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方法偶联到不溶性载体上，当将相应的抗血清（或抗原）按层析方法加入柱中，抗血清中的相应的抗体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随洗脱液流出。再改变缓冲液的,PH,值和离子强度，则可以使抗体和偶联在载体上的,Ag,解离（加入解脱剂），经洗脱，从而得到纯化的,Ab,。,以免疫亲和层析为例（三）免疫球蛋白片段的制备：,1,）温和 分离亚单位：（,1,）改变,PH,值,PH,3,或,10,，Ig,亚单位自动解离（,2,）利用强度性剂适合载脂蛋白,Ag,和胶原肽的提取,2,）二硫键的解离：适合于将轻、重链分开,3,）溴化氰裂解法：与蛋白质中的甲硫氨酸侧链的硫醚基起反应，生成溴化亚氨内酯,4,）酶法裂解：木瓜酶将,IgG,分解为,Fc,和,Fab,（,2,）三个片段胃蛋白酶,IgG,分解为（,Fab,）,2,和几个小肽段胰蛋白酶,IgG,切成不规则肽链 应用：木瓜酶切断，得,Fc,段，制备抗重链血清胃蛋白酶切取，得,F,（,ab,）,2,，用于诊断（用,Ab,鉴别,Ag,）,（四）纯化抗原的鉴定：,1.,含量鉴定：生化方法酚试剂法双缩脲法可见光吸收法 紫外吸收法,Ag,宝贵，少,2纯度的鉴定：醋酸纤维薄膜电泳法,经典常用聚丙烯酰胺凝胶电泳法 免疫电泳法 免疫双扩散法,ELISA,或,RIA,（放免）不纯，也可能是同一物质的聚合体或降解物较纯，也不能排除在这条带中有其他成分所以单一方法，可信度差。因而几种方法联用较可靠,三、半抗原免疫原的制备,半抗原：只有反应原性，没有免疫原性的小分子物质半抗原,+,载体,大分子物质,-,Ab,人工抗原结合方法物理法：利用电荷和微孔化学法（一）载体的选择：,1.,蛋白质：常用牛血清白蛋白,2.,多肽类聚合物：常用多聚赖,aa,3.,大分子的聚合物和某些颗粒：加入福氏佐剂可产生良好,Ab,（二）联接的方法：三个基本条件：,1.,碳化二亚胺法,;,2.,二醛法：,3.,混合酸酐法（氯甲酸异丁酯法）三）无羧基和氨基半抗原衍生物的制备：,1.,琥珀酸酐法,2.O-,（羧甲基）羟胺法,3.,一氯醋酸钠法，适用于带酚基的半抗原,4.,重氮化的对氨基苯甲酸法：适于带酚基的半抗原,四,.,佐剂：,（一）使用佐剂的目的为提高免疫原性佐剂本身可有或无免疫原性（二）机理：,1.,可直接或参与,cell,免疫反应,2.,佐剂与,Ag,混合，可以使,Ag,在局部组织的存留时间长，延长,Ag,的局部吸收。可持续刺激机体，产生高滴度,Ab,3.,佐剂可增加,Ag,表面积，并改变,Ag,的活性基因构型，从而增加,Ag,的免疫原性。,常用的佐剂和制备方法：,1.,应用最多的为福氏佐剂,不完全：石蜡油,+,羊毛脂完全：石蜡油,+,羊毛脂,+,卡介苗,2.,乳剂的制备：乳剂：,Ag,和佐剂的混合物,Ag,与佐剂比例为,1,：,1,，注射前要充分乳化乳化方法研磨法搅拌混合法,旋涡混合,抗体的制备,多,克隆抗体的制备,单克隆抗体的制备,第二节抗血清的制备,免疫原,+,佐剂,刺激动物机体,获得抗血清,一,.,动物的选择,1.,种属差异越远越好，太近不易产生良好的抗体，甚至不产生,2.,抗血清量的要求：量大，选大动物 量少，选小动物,3.,抗血清的要求：,R,型（兔型）,H,型（马型）,4.,抗原的选择：,蛋白质,Ag,大部分动物皆适合，常用家兔、山羊,IgE,对绵羊，胰岛素对家兔，,酶对山羊免疫时不产生,Ab,5.,甾体激素多用兔，酶多用豚鼠,6.,对动物个体的要求：雄性 稚龄、健康、正常、无感染,二、免疫前准备,1.,正常饲养：,3d,，观察是否健康、正常、无感染,2.,取阴性血清：耳静脉取血,二、免疫剂量、时间和途径选择原则：,1.,剂量：大动物,0.5-1mg/,只 小动物,0.1-0.6mg/,只,1,）免疫剂量不要过大，,Ag,过量，易产生免疫抑制,2,）第一次免疫剂量要小，多次免疫后可加大剂量,3,）选择合适的免疫剂量，要根据,Ag,性强弱，分子量大 小，动物大小，免疫时间而定。,2.,时间：,1,）间隔时间短，易产生免疫抑制一般第1,、,2,次间要有,10-20d,，,2,次以后,7-10d,2,）半抗原间隔时间长,3.,途径：多点注射，（足掌、腋窝,L,结周围，背部两侧，颌下，耳 后皮内或皮下注射）,Ag,宝贵，采取微量注射法,免疫程序：,1.,背部皮下多点注射,2.,淋巴结内注射,试血,1.,根据免疫程序末次免疫，从耳静脉取血,分离血清,2.,琼脂双扩散测效价,三,.,动物采血法：,抗血清鉴定,采血前，禁食动物,24h,，防止血脂过高末次免疫后，,5-7d,之内采血。否则抗血清效价,1.,颈动脉放血法：适于兔、羊,2.,心脏采血法：适于小动物,3.,静脉多次采血清免：耳中央,V,100ML,羊：颈,V,1500-2000ML,小鼠：断尾或摘除眼球,2ML,抗血清分离，灭活,5630min,第三节抗血清的鉴定和保存,一、抗血清的鉴定：免疫成功，,Ab,较纯，含有杂,Ab,免疫不成功,1.,特异性鉴定：免疫双扩散法,2.,效价的鉴定：免疫双扩散法,Ab,稀释法：不稀释,1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64,Ag 1/32,作为,Ag,效价,3.AgAb,的亲和力的鉴定,Ag+Ab,AgAb,K,值,109-1011L/mol,之间,K,值大，,AgAb,结合力大,K,值小，,AgAb,结合力小,二、抗血清其他鉴定方法,：,三、抗血清的保存：,1.4,无菌处理，防腐液体状态,3-6,月,2.20-40,度冰冻保存,5,年小包装,3.,干燥冰冻,5-10,年,第四节抗血清中抗体的纯化,目的：除去杂,Ab,1.Ab,特异性的纯化,除去杂,Ab,1,）吸附剂法,2,）亲和层析,2.,特异性,IgG,抗体的制备：,1,）盐析法粗提,V,球蛋白不同饱和度的（,NH4,）,2SO4,或,Na2SO4,2,）离子交换层析法提取,IgG,：常用,DEAE,纤维素,IgG,带正电荷，其他,pro,带负电荷,3,）亲和层析法提取特异性,IgG,4,）酶解法制备,F,（,ab,）,2,片段,第五节 单克隆抗体及基因工程抗体,一、单克隆抗体：,1,、淋巴细胞杂交瘤技术,2,、单克隆抗体,3,、单克隆与多克隆抗体比较,4,、用途,二、基因工程抗体,一、单克隆抗体,1,、,淋巴细胞杂交瘤技术,(,kohler,milstein,),淋巴细胞杂交瘤技术：,75,年才创立的技术，将在体外不能长期生存的免疫细胞与在体外能迅速增殖的骨髓瘤细胞在聚乙二醇的作用下融合产生杂交瘤细胞，所得杂交瘤细胞继承了两种细胞的能力，即保存了瘤细胞在体外迅速增殖传代的能力，又继承了免疫细胞合成与分化的能力，淋巴细胞主要,T,细胞,、,B,细胞,(T,细胞与胸腺瘤细胞融合，可产生分泌淋巴因子的,T,细胞杂交瘤,)B,细胞与 瘤细胞融合，产生能分泌特异抗体,的,B,细胞杂交瘤。,2,、单克隆抗体：,通过淋巴细胞杂交瘤技术，把产生特定抗体的,B,细胞与能无限生长的骨髓瘤的细胞融合，形成的,B,细胞杂交瘤，由这克隆化,B,的 杂交瘤所产生的抗体。纯度高，专一性强，重复性好，且能持续在动物体外或体内产生固体性抗体。,3,、单、多克隆抗体比较：,多克隆抗体,：是由多个淋巴细胞克隆产生的,(,抗原分子量大，表面决定簇多产生不 抗体,),是高度异质性，特异性低，纯度差，反应不够灵敏，限制免疫学血清学的发展，影响诊断准确性和治疗效果。,单克隆抗体,：特异性强，体外 产生，质地均一，反应灵敏，工业化生产任何多肽蛋白质特别是半抗原均可用淋巴细胞杂交瘤技术来制备单克隆抗体。,4,、单克隆抗体的应用：,单克隆抗体技术被誉为免疫学的一次革命，是,20,世纪后,20,年内最为重要的生物高技术之一。,1984,年获诺贝尔医学与生理学奖。从医、农、食品等给人带来新的希望。,多克隆抗体特异性低，纯度差，反应不够灵敏，影响诊断的准确性，及治疗效果，以及实验技术的提高，还出现血清病，过敏性休克，含量不一，无法标准化。,单克隆抗体特异性高，滴度高，质地均一，反应灵敏，可标准化等优点，可工业化大规模生产，单克隆产品诊断试剂投资少，收效快，产值高。任何多肽与蛋白如病毒、细菌、寄生虫，正常细胞及恶化细胞，各种因子受体与介质、激素、酶类和血液成份，食物品与环境的有害物，甚至一段氨基酸、核苷酸,DNA or RNA,顺序化合物半抗原，都可通过,B,细胞杂交瘤技术，制备出相应单克隆抗体。,开发癌瘤、病毒性疾病、化脓性疾病、自身免疫疾病和移植排斥反应的单抗新药，广泛应用基础研究、疾病诊断、环境、食品监测，治疗、预防提纯蛋白，优生优育等，主要应用以下几方面：,（,1,）疾病诊断,（,2,）体内显象定位检查,（,3,）体内治疗和导向治疗,（,4,）食品环境监测,（,5,）提纯蛋白与基因工程产品，用于人、动、植物各学科的分子生物学研究,5.,单克隆抗体的制备,单克隆抗体（,monoclonal,antibody,McAb,）抗原决定簇：,Ag,上特异的化学基因称,Ag,决定簇。当,Ag,免疫动物时，,Ag,的每个抗原决定簇可分别刺激相应,B cell,，因为每个,Bcell,表面的,Ag,受体只针对一个,Ag,决定簇，并产生针对该,Ag,决定簇的,Ab,。一个,Bcell,只识别一个,Ag,决定簇，并产生该,Ag,决定簇的,Ab,，称为单克隆,Ab,。这种,Ab,是均一的，且是单一特异性的。,1,种,Ag,可有多个抗原决定簇,第一节,B,淋巴细胞杂交瘤技术的原理,B,淋巴细胞杂交瘤：用人工方法使,Ab,产生,cell,与骨髓瘤,cell,融合而成，产生的一类特殊,cell,。,Ab,产生,cell,来源于小鼠脾,cell,（,B,细胞）骨髓瘤,cell,来源于同系小鼠。可大量体外增殖，长期培养杂交瘤,cell,兼有两种亲本,cell,特性，既能分泌,Ab,，又能大量增殖,一、,Bcell,杂交瘤技术的原理：,二、小鼠骨髓瘤,cell,的筛选：,三、细胞融合剂：,PEG,多选分子量,1000-2000,PEG,的作用基理：,PEG,可改变,cell,膜脂类分子排布，使,cell,膜易脂类分子排布，使,cell,膜易被打开，最终引起,cell,融合,HAT,培养基的选择作用：,HAT,次黄嘌呤（,H,）核苷酸前体，使,cell,通过替代途径合成,DNA,氨基蝶呤（,A,）叶酸拮抗物，阻断,cell,合成,DNA,的主要途径胸腺嘧啶核苷（,T,）使,cell,通过替代途径合成,DNA,cell,合成,DNA,有两种途径：,主要途径：糖、,aa,、合成核苷酸合成,DNA,需叶酸参与氨基蝶呤（,A,）可阻,替代途径：次黄嘌呤（,H,）、胸腺嘧啶核苷（,T,）,HGPRT,TK,催化小鼠骨髓瘤,cell,都缺乏,HGPRT,，在,HAT,培养基中，不能完成完整,DNA,合成过程,易死亡杂交瘤,cell,可利用脾,C,的,HGPRT,，通过替代途径合成,DNA,杂交瘤,cell,的筛选和克隆化,1.,筛选目的：,Ab,阳性分泌的杂交瘤细胞，,ELISA,：检测,Ab,Ab,阳性细胞纯化好的单一性可溶性,Ag,，包被到微孔上,2,.,杂交瘤的克隆化：,2.1,定义：用一定方法使混合的,cell,分离成单个,cell,独立状态，再经扩大培养形成的各个,cell,群，就分别是一个克隆，这种方法称为克隆化,2.2,目的：获得目的,Ab,阳性，,Ab,分泌旺盛的杂交瘤,cell,株,2.3,克隆化方法：有限稀释法将融合,cell,用培养液充分稀释，直至每 孔只有,1,个,cell,显微操作法 琼脂平板法 细胞选分代法,2.4,再次克隆化：初次及再次克隆化之前均要检测,Ab,多次传代，,冰冻复苏的杂交瘤,cell,均要再次克隆化,第二节制备,McAb,的技术要点,一、免疫小鼠：为防止免疫反应不佳或中途死亡，应同时免疫,3-4,只小鼠,Ag,纯,选用与骨髓瘤,cell,同源的,BALB/C,小鼠,二、培养骨髓瘤,cell,：与待融合脾,cell,同源选生长旺盛，形态良好，处于对数生长期的,cell,以供融合用避免,cell,反祖，用,8-AG,处理,cell,切忌过多传代,三、收集脾,cell,分离脾之前，要检测,Ab,。采脾，制成悬液,四、采取饲养,cell,五、,cell,融合：是杂交瘤的中心环节，,PEG,融合,六、检测,Ab,Ab,检测结果,+,阳性,cell,克隆化,-,更换动物，避免无效试验检测,Ab,，一般选用,ELISA,或,RIA,（放免）目的：找到阳性细胞株,七、单个细胞培养,八、制备,McAb,九、阳性细胞的冻存和复苏,十、,McAb,的纯化,盐析法粗提半饱和硫酸铵沉淀进一步纯化 根据,McAb,性质层析离子交换层析,IgG,亲和层析,IgG,、,IgM,十一、,McAb,的鉴定,1.Ig,类型测定,2.,特异性测定,3.,抗体效价测定,4.,决定簇测定,5.,亲和性测定,K,K1/K2,K,：,109-1011L/mol,二、基因工程抗体：,自,80,年代起开始了基因工程抗体,(genetic engineering antibody),的研究工作。,制备基因工程抗体的基本过程首先是获得抗体的基因片段，可从,B,细胞,DNA,库中筛选；用探针从杂交瘤细胞、免疫脾细胞的,DNA,库中或,cDNA,库中筛选，或以,PCR,法直接扩增等。然后将抗体基因片段导入真核细胞,(,如杂交瘤细胞),或原核细胞,(,如大肠杆菌等,),，使之表达具有功能活性的抗体片段。,目前已获表达产物的重组抗体主要有以下几种类型。,1,、嵌合抗体,(,chimeric,antibody),将小鼠,VH,基因与人,CH,基因,(1,或,2,重莲,),连接后导入骨髓瘤细胞，使之表达嵌合重链。再将小鼠杂交瘤细胞的,VL,与人,CL,基因相连，转染含嵌合重链的小鼠骨髓瘤细胞，经过筛选，得到能分泌人,鼠嵌合抗体的骨髓瘤细胞，其所分泌的嵌合抗体与原杂交瘤细胞分泌的抗体特异性及亲和力相同，但减少了其中的鼠源性成分。,基因工程技术制备,McAb,2,、重构型抗体,为进一步减少抗体蛋白中鼠源性成分的比例，可将鼠抗体的超变区基因嵌入人抗体,Fab,段骨架区的编码基因中，再将此,DNA,片段与人,Ig,恒定区基因相连，然后转染杂交瘤细胞，使之表达嵌合的,V,区抗体。,3,、单链抗体,将抗体,VL,羧基端基因序列与,VH,氨基端基因序列连接成单链的抗体,V,区基因，将它转入大肠杆菌使之表达能与抗原结合的单链抗体。,此抗体之优点是分子量很小，作为异种蛋白的免疫原性较弱，用于肿瘤导向治疗时易渗透入实体瘤内部，其缺点是此类抗体无重链稳定区，故不能介导抗体的其他效应功能。,4,、抗体库：,即用基因克隆技术将全套抗体,(repertoire),重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过在大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，筛选特异性的可变区基因。为第三代抗体，标志抗体技术发展的质的飞跃，从细胞工程抗体发展到基因工程抗体。,