血清总胆红素和结合胆红素测定[1].ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,血清总胆红素和结合胆红素测定,燕 德 起,Biobase,1,血清总胆红素和结合胆红素测定,改良,J-G,法测定血清总胆红素和结合胆红素,胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素,Biobase,2,改良,J-G,法测定血清总胆红素和结合胆红素,【,原理,】,血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应，产生偶氮胆红素；非结合胆红素须有加速剂咖啡因,-,苯甲酸钠,-,醋酸钠作用，其分子内氢键破坏后才能与重氮试剂反应，也产生偶氮胆红素。本法重氮反应,pH6.5,，最后加入碱性酒石酸钠使紫色偶氮胆红素,(,吸收峰530nm),转变成蓝色偶氮胆红素，在,600nm,波长比色，使检测灵敏度提高。,Biobase,3,改良,J-G,法测定血清总胆红素和结合胆红素,【,试剂,】,1,咖啡因,-,苯甲酸钠试剂 称取无水醋酸钠,41.0g,，苯甲酸钠,38.0g,，乙二胺四乙酸二钠,(EDTA-Na2)0.5g,，溶于约,500ml,去离子水中，再加入咖啡因,25.0g,，搅拌使溶解,(,加入咖啡因后不能加热溶解,),，用去离子水补足至,1L,混匀。滤纸过滤，置棕色瓶，室温保存。,2,碱性酒石酸钠溶液 称取氢氧化钠,75.0g,，酒石酸钠,(Na2C4H4O6?2H2O)263.0g,，用去离子水溶解并补足至,1L,，混匀。置塑料瓶中，室温保存。,3,72.5mmol/L,亚硝酸钠溶液 称取亚硝酸钠,5.0g,，用去离子水溶解并定容至,100ml,，混匀，置棕色瓶，冰箱保存，稳定期不少于,3,个月。作,10,倍稀释成,72.5mmol/L,，冰箱保存，稳定期不少于,2,周。,4,28.9mmol/L,对氨基苯磺酸溶液 称取对氨基苯磺酸,(NH2C6H4SO3H?H2O)5.0g,，溶于,800ml,去离子水中，加入浓盐酸,15ml,，用去离子水补足至,1L,。,5,重氮试剂 临用前取上述亚硝酸钠溶液,0.5ml,和对氨基苯磺酸溶液,20ml,，混匀即成。,6,5.0g/L,叠氮钠溶液。,Biobase,4,改良,J-G,法测定血清总胆红素和结合胆红素,【,试剂,】,7,胆红素标准液,(1),目前一般用游非结合胆红素配制标准液，此标准品须用含白蛋白的溶剂配制，常用人混合血清，对此血清的要求如下：,收集无溶血、无黄疽、无脂浊的新鲜血清，混合，必要时可用滤菌器过滤。取过滤后的血清,1ml,，加入新鲜,0.154mmol/L,NaCl,溶液,24ml,，混合。在,414nm,波长，,1cm,光径，以,0.154mmol/L,NaCl,溶液调零点，其吸光度应小于,0.100,；在,460nm,的吸光度应小于,0.04,。,(2),配制标准液的胆红素须符合下列标准：纯胆红素的氯仿溶液，在,25,条件下，光径,1.000,0.001cm,，波长,453nm,，摩尔吸光系数应在,60 700,1 600,范围内；改良,J-G,法偶氮胆红素的摩尔吸光系数应在,74 380,866,。,(3),胆红素标准贮存液,(171mol/L),准确称取符合要求的胆红素,10mg,，加入二甲亚砜,1ml,，用玻璃棒搅拌，使成混悬液。加入,0.05mol/L,碳酸钠溶液,2ml,，使胆红素完全溶解后，移入,100ml,容量瓶中，以稀释用血清洗涤数次并入容量瓶中，缓慢加入,0.1mol/L,盐酸,2ml,，边加边摇,(,勿用力摇动，以免产生气泡,),。最后以稀释用血清定容。配制过程中应尽量避光，贮存容器用黑纸包裹，置,4,冰箱,3d,内有效，但要求配后尽快作标准曲线。,Biobase,5,改良,J-G,法测定血清总胆红素和结合胆红素,【,操作步骤,】,混匀后，波长,600nm,，对照管调零，读取吸光度，在标准曲线上查出相应的胆红素浓度。,Biobase,6,改良,J-G,法测定血清总胆红素和结合胆红素,标准曲线制作,混匀,(,不可产生气泡,),，按总胆红素测定法操作。每一浓度作,3,个平行管，并分别做标准对照管，用各自的标准对照管调零，读取标准管的吸光度。配制标准液用的溶剂血清中尚有少量胆红素，同样测定后得一吸光度值。每个标准管的吸光度值均应减去此吸光度，然后与相应胆红素浓度绘制标准曲线,Biobase,7,改良,J-G,法测定血清总胆红素和结合胆红素,【,参考范围,】,血清总胆红素：,5.1,19mol/L(0.3,1.1mg/dl),；,血清结合胆红素：,1.7,6.8mol/L(0.1,0.4mg/dl),。,【,临床意义,】,1,血清总胆红素测定的意义,(1),有无黄疸及黄疸程度的鉴别。,(2),肝细胞损害程度和预后的判断 胆红素浓度明显升高反映有严重的肝细胞损害。但某些疾病如胆汁淤积型肝炎时，尽管肝细胞受累较轻，血清胆红素却可升高。,(3),新生儿溶血症 血清胆红素有助于了解疾病严重程度。,(4),再生障碍性贫血及数种继发性贫血,(,主要见于癌或慢性肾炎引起,),，血清总胆红素减少。,Biobase,8,改良,J-G,法测定血清总胆红素和结合胆红素,【,临床意义,】,2,血清结合胆红素测定的意义 结合胆红素与总胆红素的比值可用于鉴别黄疸类型。,(1),比值,20%,溶血性黄疸，阵发性血红蛋白尿，恶性贫血，红细胞增多症等。,(2),比值,40%,60%,肝细胞性黄疸。,(3),比值,60%,阻塞性黄疸。,但以上几类黄疸，尤其是,(2),、,(3),类之间有重叠。,Biobase,9,改良,J-G,法测定血清总胆红素和结合胆红素,【,注意事项,】,1,胆红素对光敏感，标准液及标本均应尽量避光保存。,2,轻度溶血对本法无影响，但严重溶血时可使测定结果偏低。其原因是血红蛋白与重氮试剂反应形成的产物可破坏偶氮胆红素，还可被亚硝酸氧化为高铁血红蛋白而干扰吸光度测定。血脂及脂溶色素对测定有干扰，应尽量取空腹血。,3,叠氮钠能破坏重氮试剂，终止偶氮反应。凡用叠氮钠作防腐剂的质控血清，可引起偶氮反应不完全，甚至不呈色。,4,本法测定血清总胆红素，在,10,37,条件下不受温度变化的影响。呈色在,2h,内非常稳定。,Biobase,10,改良,J-G,法测定血清总胆红素和结合胆红素,【,注意事项,】,5,标本对照管的吸光度一般很接近，若遇标本量很少时可不作标本对照管，参照其他标本对照管的吸光度。,6,胆红素大于,342mol/L,的标本可减少标本用量，或用,0.154mmol/L,NaCl,溶液稀释血清后重测。,7,结合胆红素测定在临床上应用很广，但至今无候选参考方法，国内也无推荐方法。方法不同，反应时间不同，结果相差很大。时间短、非结合胆红素参与反应少，结合胆红素反应也不完全；时间长，结合胆红素反应较完全，但一部分非结合胆红素也参与反应。这是一个很难权衡的问题。在没有结合胆红素标准液的情况下，问题更复杂。,Biobase,11,改良,J-G,法测定血清总胆红素和结合胆红素,H,【,评价,】,1,灵敏度和线性范围 本法摩尔吸光系数为,74 380,，标本中胆红素,17.1mol/L,时吸光度约,0.08(,血清用量已达,0.2m1),，正常血清总胆红素多数小于,17.1mol/L,，手工法测定显得灵敏度很不够。在病理血清结合胆红素增高在,17.1mol/L,以下时，灵敏度同样不够。线性上限虽可做到,1.7,吸光度，但手工法在胆红素超过,171mol/L,时，吸光度已达,0.8,，应减量操作。分析仪检测灵敏度高得多，最低吸光度可测至,0.02,，线性上限可达,342mol/L,；但本法需,3,次加试剂，一般无法在全自动生化分析仪中使用。,2,精密度 正常浓度时精密度较差，特别是批间,CV,，据报道为,14%,20%,；而胆红素,342mol/L,时，精密度佳，批内,CV,为,0.95%,，批间,CV5%,10%,。,Biobase,12,改良,J-G,法测定血清总胆红素和结合胆红素,H,【,评价,】,3,重氮反应法测定胆红素，也可用甲醇,(M-E,法,),或二甲亚砜等作加速剂，可做成单一试剂，反应,pH,和显色,pH,都在酸性，,560nm,波长比色，易于自动化。但灵敏度比改良,J-G,法略低，,M-E,法摩尔吸光系数为,60 500,，,Hb,干扰较明显，,Hb,1g/L,时，需用样品空白校正。,4,本法灵敏度高，且可避免其它有色物质的干扰，是测定血清总胆红素的参考方法，但不能自动化分析是其缺点。现有些商品试剂盒称咖啡因法或,J-G,法，但不加碱性酒石酸，即不在碱性条件下显色，其灵敏度和特异性不如上述方法。,Biobase,13,胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素,【,原理,】,胆红素呈黄色，在,450nm,附近有最大吸收峰。胆红素氧化酶,(BOD),催化胆红素氧化，随着胆红素被氧化，,A450nm,下降，下降程度与胆红素被氧化的量相关。在,pH8.0,条件下，未结合胆红素及结合胆红素均被氧化，因而检测,450nm,吸光度的下降值可反映总胆红素含量；加入,SDS,及胆酸钠等阴离子表面活性剂可促进其氧化。,在,pH3.7,4.5,缓冲液中，,BOD,催化单葡萄糖醛酸胆红素,(,mBc,),、双葡萄糖醛酸胆红素,(,dBc,),及大部分,胆红素氧化，非结合胆红素,(Bu),在此,pH,条件下不被氧化。用配制于人血清中的二牛磺酸胆红素,(,ditaurobilirubin,，,DTB),作标准品，检测此条件下,450nm,吸光度的下降值可反映结合胆红素的含量。,Biobase,14,胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素,【,试剂,】,1,0.1mol/LTris-HCl,缓冲液,(pH8.2),称取三羟甲基氨基甲烷,(Tris)1.211g,，胆酸钠,172.3mg,十二烷基硫酸钠,(SDS)432.6mg,，溶于去离子水,90ml,中，在室温,(25,30),用,1mol/L,盐酸调节,pH,至,8.2(,约用,6ml),，再加蒸馏水至,100ml,，置冰箱保存，此液含,4mmol/L,胆酸钠、,15mmol/L SDS,。,2,0.2mol/L,磷酸盐缓冲液,(pH4.5),。,3,BOD,溶液 如系冻干品，按说明书要求复溶，但复溶后冰箱保存不宜过长,(,约可保存,1,周,),，如系液体,(,可能含有甘油,),，置,4,冰箱可保存较长时间，,BOD,贮存溶液的酶活性一般在数千至,1,万,2,万,U/L,，,BOD,工作液酶活性可按反应液中,BOD,终浓度达,0.3,1.0U/ml,计算。,4,总胆红素标准液,(342mol/L),按胆红素测定,J-G,法中方法配制，或市售合乎要求的标准液。,5,结合胆红素标准液 将,DTB,配于胆红素浓度可忽略不计的人血清中，或用冻干品按说明书要求重建。配制后分装于聚丙烯管内，,70,保存，可稳定,6,个月。冻干品未重建前置低温中，至少稳定,1,年。,Biobase,15,胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素,【,操作步骤,】,总胆红素和结合胆红素测定分别按表,Biobase,16,胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素,加入,BOD,工作液后立即混匀，置,37C,水浴,5min,，用分光光度计，在,450nm,波长，去离子水调零，读取各管吸光度,(A),。用于对照管的比色杯与非对照管的比色杯不得混用。,Biobase,17,【,计算,】,血清总胆红素,(,mol,/L),C,总胆红素,血清结合胆红素,(,mol,/L),CDTB,【,参考范围,】,与重氮法相似，,总胆红素为,10.26,4.10mol/L(n=97),，,结合胆红素为,2.57,2.56mol/L(n=95),。,胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素,Biobase,18,胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素,【,注意事项,】,1,BOD,浓度的选择 文献报道,BOD,在反应液中终浓度为,0.18,1.14U/ml,。国内有些厂家的试剂盒，,BOD,在反应液中终浓度按标示值计算很高，但反应速度很慢。,2.,选择,BOD,浓度时，可根据所用制品在测定高胆红素血清标本或,342mol/L,标准液的反应速度，即能否在,5min,反应完全而确定。由于测定结合胆红素时反应液,pH,偏离,BOD,的最适范围，因此要求,BOD,有较高的浓度，一般使反应液中终浓度不低于,0.5U/ml,。,Biobase,19,胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素,【,注意事项,】,3,Hb,在,1.0g/L,以下时，对结果影响不大。每升血清中分别加入维生素,C 0.1g,、半胱氨酸,0.5g,、谷胱苷肽,0.5g,、尿素,0.5g,、尿酸,0.5g,、葡萄糖,10g,、乙碘醋酸,1g,、白蛋白,40g,对总胆红素及结合胆红素测定几乎无干扰。每升血清中加,L-,多巴,0.15g,、,-,甲基多巴,0.15g,使结果偏低约,10%,。,4,BOD,的最适,pH,在,pH7.3,9.0,之间酶活性的,pH,曲线变化幅度不大，但最适,pH,为,8.0,8.2,。但在测定结合胆红素时，为防止,Bu,反应，选择,pH,为,4.5,，这时样本中,mBc,、,dBc,及大部分,胆红素被氧化；,pH,低于,4.0,时，血清样本易发生混浊，严重干扰测定结果；郭健等报道，用枸橼酸盐、磷酸盐、硼酸盐和碳酸盐缓冲液比较时，枸橼酸盐缓冲液,(0.1mol/L,，,pH5.0),效果最好。,Biobase,20,胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素,5,结合胆红素标准品 合成的二牛磺酸胆红素,(DTB),为水溶性化合物，可与重氮化氨基苯磺酸直接反应，产生吸收光谱与偶氮胆红素相似的偶氮色素。用,J-G法测得的摩尔吸光系数与,Bu,相同。,20,世纪,80,年代后期以来，国外结合胆红素测定大多用,DTB,作标准品。,DTB,反应前后的吸收光谱与,Bu,相似，最大吸收峰也在,450,460nm,之间。,6,混浊问题,Doumas,报道，成人黄疸血清或肝素抗凝血浆，反应,15min,几乎均产生混浊而影响结果。在磷酸盐缓冲液中加入尿素可防止混浊。经电泳证明混浊是因球蛋白及纤维蛋白原沉淀引起。应避免使用肝素抗凝。,7,光对,BOD,法测定结合胆红素有较大影响。经过蓝光治疗的新生儿黄疽血清，用,BOD,法测定结合胆红素结果远比,J-G,法高，属假性增高。新生儿血清在体外经蓝光照射后，用高效液相色谱法HPLC),未检出结合胆红素，重氮法结果通常保持不变，但,BOD,法结果显著增高。蓝光照射能产生光胆红素，其在,pH3.7,易被,BOD,氧化。此种假性增高对临床监控新生儿黄疽及鉴别生理性黄疽与初期的病理性黄疽有影响。,Biobase,21,胆红素氧化酶法测定总胆红素和结合胆红素,【,评价,】,1,BOD,法特异性高，手工操作简便快速，也适合于自动生化分析仪操作。结合胆红素的,BOD,法测定，解决了长期以来用重氮反应法测定总胆红素和结合胆红素条件的不同，包括试剂种类和浓度的不同，以及结合胆红素结合胆红素反应时间不同造成测定值变异大的问题，提高了结合胆红素分析的特异性和准确度。,2,本法测定结合胆红素，灵敏度和线性上限均较重氮反应法高。但手工分析因受分光光度计检测范围限制，只能做到,342mol/L,左右，分析仪测定上限可到,427.5mol/L,，最高达,598.5mol/L,。但需受,BOD,用量的限制。,3,由于,BOD,来源困难，价格高，目前尚无国产试剂盒提供，而进口试剂则价高，故此法尚很少在临床实验室应用。,Biobase,22,谢谢大家!,End,Biobase,23,