Western Blot 技术原理及常见问题分析2.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,Western blot,技术原理及,常见问题分析,Western Blot,简介及原理,Western Blot,一般流程,Western Blot,常见问题分析,Western Blot,简介：,印迹法（,blotting,）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。,1975,年，,Southern,将,DNA,转移到硝酸纤维素膜（,NC,膜）上，并利用,DNA,RNA,杂交检测特定的,DNA,片段，称为,Southern,印迹法。,而后人们用类似的方法，对,RNA,和蛋白质进行印迹分析，对,RNA,的印迹分析称为,Northern,印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为,Western,印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为,Eastern,印迹法。,Western Blot,基本原理,Western Blot,优点,高分辨率的电泳技术,特异敏感的抗原,-,抗体反应,1-5ng,中等大小的靶蛋白,Western Blot,应用,目的蛋白的表达特性分析,目的蛋白与其它蛋白的互作,目的蛋白的组织定位,目的蛋白的表达量分析,Western Blot,流程,蛋白样品的制备,SDS-PAGE,转膜,封闭,一抗杂交,二抗杂交,底物显色,蛋白样品的变性,2SDS-PAGE,上样缓冲液：,DTT,可临用前以,1,：,4,比例混合加入，亦可全部配好分装，,-20,冻存。,按,1:1,比例与蛋白质样品混合，,95,100,加热,5,15min,，冰上冷却后再上样，上样量一般为,20-25,l,，总蛋白量,20,50,g,。,1M Tris-HCl(pH6.8),10 ml,1M DTT,20 ml,SDS,4 g,甘油,20 ml,溴酚蓝,0.2 g,总体积,100ml,100mM Tris-HCl(pH6.8),200mM DTT,4%SDS,0.2%,溴酚兰,20%,甘油,ddH,2,O,SDS,(,十二烷基硫酸钠,),：,阴离子去污剂 变性剂,氨基酸侧链与,SDS,充分结合形成带负电荷的蛋白质,-SDS,胶束。,蛋白质,-SDS,胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。,与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。,不连续的电泳缓冲体系。,SDS,蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,Hoeher,电泳系列,凝胶成分,丙烯酰胺和,N,N,-,亚甲基双丙烯酰胺,神经毒素！,SDS,配胶的,Tris,缓冲液,TEMED,神经毒素！,过硫酸铵,(AP,）,神经毒素！,Tris-,甘氨酸电泳缓冲液,凝胶浓度与蛋白分离范围,凝胶浓度（）,线性分离范围（,KD),15,12-43,10,16-68,7.5,36-94,5.0,57-212,SDS-PAGE,浓缩胶,(5%Acrylamide),及分离胶配方表：,隔绝空气,ddH,2,O,0.1%SDS:8%,灌制浓缩胶 插入梳子,浓缩胶,分离胶,样品,加样槽,蛋白质分子的迁移方向,1 2 3 M,电泳之后凝胶染色扫胶,DNR BIS910,凝胶成像系统,注意：,做,western blot,通常用预染,maker,！,转膜,要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如,NC,膜）上，通常有两种方法：,毛细管印迹法和电泳印迹法,。,常用的电泳转移方法有,湿转和半干转,。两者的原理完全相同，只是用于固定胶,/,膜叠层和施加电场的机械装置不同。,转移膜的选择,最常用于,Western Blot,的转移膜主要是硝酸纤维素（,Nitrocellulose,，,NC,）膜和聚偏二氟乙烯（,Polyvinylidene Fluoride,PVDF,）膜，此外也有用尼龙膜、,DEAE,纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和,NC,膜的特点相似,主要用于核酸杂交。,各种膜的详细特点介绍：,Blot,膜封闭液（生物试剂公司,）,室温孵育,1h,或,4,过夜,注：,Tween-20,的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。,一抗、二抗孵育,1.,把NC,膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以,0.1mL/cm,2,的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育,1-2,小时或,4,过夜。,2.,用,TBST,漂洗膜,3-5,次，每次,5-10min,。,3.,加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育,1-2,小时或,4,过夜。,4.,用,TBST,漂洗膜,3,次，每次,5-10min,。,5.,最后用,TBS,漂洗膜,2,次，每次,10min,。,6.,加入显色底物进行显色反应。,加入一抗，,室温孵育,1-2,小时或,4,过夜,洗膜,加入二抗，,室温孵育,1-2,小时或,4,过夜,洗膜,显色,不同标记的二抗及成像方法,125,I,标记的抗体,X-,光片压片显色,荧光基团标记的抗体,凝胶成像仪,不同标记的二抗及成像方法,酶标抗体,：如,HRP,（辣根过氧化物酶）、,AP,（碱性磷酸酶）等,成像方法,：加酶的底物产生,显色,反应或,化学发光,反应,显色反应：,TMB,，,CN,，,DAB,等显色底物,优点：方便、便宜，直接成像,缺点：有毒、灵敏度较低、背景高、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测,化学发光,显色：,标,HRP,二抗加,ECL,底物发光反应压片或,CCD,成像,优点：灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、,特异性高、可重新剥离检测,灵敏度：二者接近！,CCD,胶片曝光,压片,vs.CCD,成像,压片,CCD,成像,价格,便宜，但需要不断投入,比较贵，但只需一次投入,需要暗室,是,否,有毒？,有毒，污染环境,无毒，环保,操作,复杂,简便快速，且可连续曝光不同时间,成像质量,压片后需要二次成像，图像有一定损失,一次拍照，永久保存,是否能直接叠加,Marker,否，需要比对划线,是，快速直接叠加,动态范围,比较小,宽，可达到,4.6,个数量级,是否可以定量分析,否,是，仪器自带分析软件,压片实例,压片,：无法准确获得目的条带的大小，只能固定胶片位置在胶片上标出,Marker,的大概位置,CCD,成像,动态范围大，能直接叠加,Marker,，便于后期图像的处理及分析,Marker,直接叠加在化学发光图像上,Western Blot,化学发光成像,特推荐东胜创新经营,DNR,公司,MicroChemi,化学发光检测系统，灵敏度高，操作简便功能齐全，价格实惠,产品,特点：,高灵敏度：,超亮大光圈镜头、大尺寸科学级,CCD,、,-60,低温制冷三重配置为检测化学发光信号带来高灵敏度、高质量的成像效果,一键拍照：,整个拍照过程只需点击一个按钮，即可获得精准高质图像,快速叠加,Marker,：,落射白光实现样品与,Marker,的准确定位，方便快速在,Western,的图像上直接叠加,Marker,可清洗的样品盘：,可完全抽出清洗，避免样品间的交叉污染和实验台面的污染，延长仪器的使用寿命,其他成像方法示例,Western Blot,结果分析,目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。,分析软件如,GelQuant,等,Western Blot,常见问题分析,SDS-PAGE,电泳,胶不平？,凝胶漏液？,胶玻璃板洗刷干净,加入,AP,和,TEMED,的量要合适,加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀,温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀,两块玻璃板底部要对齐,条带比正常的窄？,“,微笑,”,或,“,倒微笑,”,条带？,条带微弱？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓,拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲,样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度,胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,蛋白浓度不够，加大上样量,蛋白样品是否保存良好，不能反复冻融，提取过程防止蛋白降解,SDS-PAGE,电泳,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲？,条带歪斜或漂移？,单个或多个白点？,转膜缓冲液过热,？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡,5-10min,电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸,确保膜和凝胶之间没有气泡,缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,转移到膜上的蛋白很少,蛋白分子量,10KD,蛋白的等电点,9,SDS,浓度不合适,凝胶太厚,原因,对,策,蛋白分子量,10KD,时，减少转膜时间；使用小孔径的膜,更换高,pH,值,Buffer,在阴极,buffer,中加入,0.005-0.01%SDS,可提高转膜效率,延长转膜时间,膜没有均匀浸湿,膜或者缓冲液污染,封闭不充分,抗体与封闭剂出现交叉反应,抗体浓度过高,原因,对,策,PVDF,膜转膜前用,100%,甲醇将膜完全浸湿，转膜前用缓冲液浸泡,10min,拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液,更换封闭剂或延长封闭时间,检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应,如有，更换封闭剂或抗体,做预实验检测确定一抗、二抗的最佳工作浓度,背景太高,杂交信号很弱或没有,抗体不适合于,western blot,抗体,浓度太低,抗体保存不当,抗原不充足,膜的漂洗过度,转膜不充分,原因,对,策,设置阳性对照和内参蛋白,加大抗体浓度,抗体长期保存应在,70,，使用前做效价检测,增加蛋白上样量，用已知标准量蛋白做参照,减少漂洗的时间和次数,一抗不是唯一特异的,二抗出现非特异结合,原因,对,策,制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点制备抗体,设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合,出现非特异带,谢谢大家！,