RT-PCR课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,RT-PCR,生物化学与分子生物学研究所,一、定义,二、逆转录,逆转录,(reverse transcription),以,RNA,为模板，合成与其互补的,DNA,的过程。,逆转录酶,(,依赖,RNA,的,DNA,聚合酶,),1.RNA,指导的,DNA,聚合酶活性,2.RNA,水解酶活性,3.DNA,指导的,DNA,聚合酶活性,过 程,试管内逆转录反应,First strand,cDNA,synthesis,反应体系的基本成分,模板,:,组织或培养细胞,RNA,。,引物,:,oligo,dT,random primer,等。,逆转录酶：,AMV:,禽类成髓细胞性白血病病毒,M-MLV,：莫洛尼,鼠白血病病毒,RNA,酶抑制剂,底物：等浓度的四种,dNTP,反应环境,:,缓冲液（,RT buffer,）,随机引物法,是三种方法中特异性最低的,引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的,cDNA,。为了获得最长的,cDNA,，需要按经验确定每个,RNA,样品中引物与,RNA,的比例。随机引物的起始浓度范围为,50,到,250ng,每,20l,反应体系。,Oligo(dT,),比随机引物特异性高,它同大多数真核细胞,mRNA 3,端的,poly(A,),尾杂交。因为,poly(A)+RNA,大概占总,RNA,的,1%,到,2,，所以与使用随机引物相比，,cDNA,的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，,oligo(dT,),一般不需要对,RNA,和引物的比例及,poly(A,)+,选择进行优化。建议每,20l,反应体系使用,0.5g,oligo(dT,),。,oligo(dT)12-18,适用于多数,RT-PCR,。,基因特异性引物（,GSP,）,对于逆转录步骤是特异性最好的引物。,First strand,cDNA,synthesis,反应的条件,加入模板，引物，,dNTP,，,DEPC-H2O,（冰上）,65,，,5min,（变性）；冰上放置,加入,10XRT buffer,，,RNasin,，,RT,，,DEPC-H2O,42/50(,根据所购试剂盒酶的性质），,60min,（延伸）,85,处理,5m,，立即放置到冰上,（酶失活）,加入,1l,的,RNaseH,，,37,处理,20m,（降解,RNA,）,取出,2-5l,进行,PCR,试验,/,分装，,-20,保存,按试剂盒说明进行,三、聚合酶链式反应,-PCR,一种将微量的目的,DNA,片段在体外快速、大量,扩增的技术。,以目的,DNA,（待扩增,DNA,）分子为模板，以一,对分别与模板,3,末端互补的寡核苷酸片段为引物，,在,DNA,聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着,模板链延伸直至完成,2,条新,DNA,链的合成。不断重复,这一过程，即可使目的,DNA,片段得到扩增。,PCR,试管内模拟细胞内,DNA,半保留复制,PCR,反应体系的基本成分,模板,DNA:,基因组,DNA,、,cDNA,等,特异引物,:,与模板,DNA,特异互补的单链寡聚,dNTP,片段，一般,18-30,上下游引物,0.2-0.5,mol/L,，,设计原则？,DNA,聚合酶,:,具耐热性、如,Taq,酶,0.5-5U/100,l,底物,:,等浓度的四种核苷酸（,dNTP,）,20-200,mol/L,反应环境,:,含有,Mg2,的,Tris-Cl,缓冲液。,PCR,反应的条件,预变性：,94,，,2-10min,变性：,94,30s,模板,DNA,变性成为单链,退火：,Tm-5,30s,，引物与模板,DNA,结合,延伸：,72,，,DNA,聚合酶催化,DNA,合成,时间与待扩增片段长度有关，,1Kb,延长时间,重复,25-30cycle.,最终延伸：,72,，,10min,。,RT-PCR,应用,获得目的基因（编码蛋白）,RNA,定性及半定量分析,Marker,组,1,组,2,内参基因,目的基因,组,1,：,control,组,2,：药物处理后,实验内容,RT-PCR,扩增小鼠肝组织,-,actin,基因,RNA,质量的高低影响实验的成败。,RNA,完整性：,RNA,酶（,RNase,）是导致,RNA,降解最主要的物质。此酶广泛存在，且非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的,RNase,完全失活。因此，,RNA,提取时最需要注意的是,RNA,酶的失活处理。,防止,DNA/,蛋白质的污染,一、,RNA,的提取,处理方法,RNase,广泛存在于人的皮肤上，因此制备,RNA,时必须,戴手套,。,RNase,的又一污染源是,移液器,。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以,DEPC,配制的,70%,乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。,玻璃和金属物品,250,烘烤,3,小时以上。,枪头、,Ep,管,等塑料制品,RNase,-free,的枪头与,Ep,管（贵）,处理：,DEPC-H,2,O,浸泡,在玻璃容器中注入去离子水，加入,DEPC,使其终浓度为,0.05%-0.1%,（,DEPC-H2O,），,37,过夜。（,DEPC,二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用）,将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入,DEPC-H2O,，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中,37,或室温下处理过夜。,将装有,DEPC-H2O,处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭菌至少,30,分钟。,将,DEPC-H2O,高压处理。,TRIzol,是一种新型总,RNA,抽提试剂，,TRIzol,的主要成分是酚。主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制,RNA,酶活性，因此,TRIzol,中还加入了,8,羟基喹啉、异硫氰酸胍、,-,巯基乙醇等来抑制内源和外源,RNase,。,8,羟基喹啉,，与氯仿联合使用可增强对,RNase,的抑制,异硫氰酸胍,是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，,并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速,与核酸分离。,-,巯基乙醇,主要破坏,RNase,蛋白质中的二硫键。,抽提方法：,TRIzol,实验步骤,取,100mg,小鼠肝组织，加入,0.5,ml,TRIzol,试剂，用匀浆器打匀,(,Trizol,预先放于冰上，充分打匀,),，转移至,ep,管中。,2.,加入,0.5ml,TRIzol,冲洗匀浆器，转移至,Ep,管中，吹打混匀,10,次，室温放置,5 min,。,3.,加入,200 l,氯仿，,剧烈,震荡混匀,15s,，室温静置,3 min,。,4.,12000rpm,，,4,离心,15 min,。,将上清液小心转移到新的,1.5 ml,离心管中，加入,0.5ml,异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置,10min,。（注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。12000rpm,，,4,离心,10 min,。,7.,小心弃去上清液，防止,RNA,沉淀丢失。,用,70%,乙醇（,DEPC,处理的水配制）洗涤,1,次，加入,1ml,乙醇，将,RNA,沉淀弹起，漂洗。（,RNA,于,70%,乙,醇中非常稳定，,-20,可存,1,年）,9.,7500rpm,，室温离心,10min,。,10.,尽可能彻底地弃去上清，防止,RNA,沉淀丢失。,真空离心干燥,35,分钟，或放在室温下使乙醇完全,挥发掉（不可过干）。,12.,沉淀用,20 l DEPC-H2O,溶解，如发现沉淀难溶，,60,处理,10 min,。,13.,测定,RNA,浓度与纯度,(A260/A280),，分装，,-70,保,存，短期使用。,注意事项,TRIzol,试剂含有苯酚，具有,毒性和刺激性,，操作时注意。,操作过程中,RNase,污染的主要来源是手和空气中的浮沉，注意配带,手套,，,迅速操作,，管盖盖严；点酒精灯。,细胞裂解必需充分。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分,RNA,会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质,裂解细胞时最好在,低温下操作,，防止在操作过程中释放的内源,RNase,降解了,RNA,。,吸取上清时，宁少勿滥（防止,DNA/,蛋白质污染）。,二、逆转录,-,PCR,两步法,RT,与,PCR,分开进行,各自在最优化的条件下进行,两步法通常是取第一步反应,产物的,1/10,进行第二步反,应，使得其灵敏度不如一步法,高。,多个基因的,RT-PCR,一步法,RT,与,PCR,同时进行,RT,和,PCR,都不能在最佳条件,下进行并且容易相互干扰,简便操作、减少污染的可能性,由于得到的全部,cDNA,产物都一,起经,PCR,扩增，使得一步法的灵,敏度更高,一步法反应体系,Tiangen,KR113,10RT-PCR Buffer 2.5l,dNTP,Mix,（,10mM each,）,1l,5RT-PCR enhancer 5l,Hotmaster,Taq,酶,1.25l,Quant,RTase,0.25l,actin,上游引物（,10mol/L,）,1.5l,actin,下游引物（,10mol/L,）,1.5l,模板,RNA 2l,DEPC-H,2,O 10l,总体积,25l,操作步骤,1.,按上述体系加入各成分，每管体积,25,l,。,注意：若需要进行多个,RT-PCR,反应，可将各组分加倍混,匀后再分装到每个反应管中，可以减少实验操作,产生的误差，使所取的试剂体积更准确，减少试,剂损失。,2.,启动,PCR,仪器直到温度上升至,50,，将反应管放入,PCR,仪中。,3.PCR,反应条件如下表：,4.1%,琼脂糖凝胶电泳（,90V,，,40min,），观察结果。,步骤,反应,时间,温度,1,逆转录反应,30min,50,2,PCR,初始变性,2min,94,3,变性,30sec,94,4,退火,30sec,58,5,延伸,1min,65,6,重复,3-5,步，,30,个循环,7,最终延伸,10min,65,小鼠,-actin,扩增引物：,上游引物序列：,5,-TGGTGGGAATGGGTCAGA-3,；,下游引物序列：,5,-ACGGTTGGCCTTAGGGTT-3,；,扩增片段,218bp,