实时荧光定量PCR原理课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实时荧光定量PCR,主讲人：廖旭东,PCR定义,PCR 简称聚合酶链式反应。聚合酶链式反应，是,指在,体外,，,酶促合成特异,性,DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火,和,适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时,的,特点。,DNA,聚合酶以单链,DNA,为模板，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链,DNA,模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。,PCR,反应条件,PCR反应条件为温度、时间和循环次数。,温度,与时间,的,设置,：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。,对于较短靶基因可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用,94,变性，,65,左右退火与延伸,(,此温度,Taq DNA,酶仍有较高的催化活性,),。,温度与时间的具体分析,变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致,PCR,失败的最主要原因。一般情况下，,93,94lmin,足以使模板,DNA,变性，若低于,93,则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或,PCR,产物完全变性，就会导致,PCR,失败。,温度与时间的具体分析,退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基,因,序列的长 度。,温度与时间的具体分析,对于,20,个核苷酸，,55,为选择最适退火温度的起点较为理想。,复性温度,=,解链温度,-(5,10),在解链温度允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高,PCR,反应的特异性。复性时间一般为,30,60sec,，足以使引物与模板之间完全结合。,温度与时间的具体分析,延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：,7080,150核苷酸/S/酶分子,70,60核苷酸/S/酶分子,55,24核苷酸/S/酶分子,高于90时，DNA合成几乎不能进行。,温度与时间的具体分析,PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1,-,2,min是足够 的。延伸,时,间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。,循环次数,：,循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,1,3,步,25,30,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,实时,荧光,定量PCR技术：,利用,荧光信号的变化实时检测,PCR,扩增反应中,每一个循环扩增产物量的变化,，通过,Ct,值,和标准曲线的分析对,起始模板,进行,定量分析。,如何检测荧光强度呢,我们先来了解一下荧光探针。,荧光共振能量转移,要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念,我们,需要首先明确，那就是荧光共振能量转移(FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体和能量受体对,其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(110 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。,所,以我们就检测不到它的荧光。,TaqMan-,水解型探针,5,端标记有荧光报告基团,(Reporter,R),，如,FAM,、,VIC,等,，即供体。,3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher,Q),探针完整，,R,所发射的荧光能量被,Q,基团吸收，无荧光，,R,与,Q,分开，发荧光,（荧光共振能量转移原理，,FRET,）,Taq,酶可水解探针,工作原理,在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶,以,引物,为起点,沿模板53方向延伸，合成一条新的DNA互补链。每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中检测荧光,.,那我们,如何对起始模板,进行,定量,呢,？,接触过,PCR的同学与同事知道我们是,通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析,的。我们现在先搞懂,三个概念：,什么叫,扩增曲线、荧光阈值、Ct值,？,实时荧光定量PCR 原理,1,、扩增曲线,扩增曲线图：,横坐标：,扩增循环数（,Cycle,）,；,纵坐标：,荧光强度,每个循环进行一次荧光信号的收集,荧光基团,2,、荧光阈值,荧光信号阈值（threshold）,：,荧光阈值,即是阴性阳性标本的区分值。超过此荧光值的标本为阳性，低于此值为阴性的。我们把它设定在PCR扩增的指数期。,前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）,，即我们所说的基线,荧光阈值,的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准差的10倍,手动设置：,原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照荧光,的,最高值,，,同时要尽量选择进入,指数,期的最初阶段，并且保证回归系数大于,0.99,真正的信号:荧光,信号超过阈值,接触过PCR的同学与同事不知道有没有想过，为什么同一浓度的标本在,纵坐标中最后的,荧光强度,会不同，同时有时候1X10,5,的荧光强度跑得会比1X10,7,还高？带着这个疑问我们先来看看第三点：CT值。,3,、,CT,值,CT,值的定义,：,PCR,扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增,循环次数。,那CT值的特点是什么呢？我们为什么选择CT值这个参数来测算样本的浓度？让我们来看看CT值的特性。,4,、,CT,值的重现性,横轴：,PCR,反映循环数,纵轴：荧光信号量,Ct,值的特点,：,相同模板进行,96,次扩增，终点处产物量不恒定；但初始模板基本一致,Ct,值则极具重现性,模板的浓度与CT值有必然联系，它极具重现性，而和最终的荧光值的大小没有太大必然的联系，有孔间差异（另非特异）。这就解释了我们之前的为什么同一浓度的标本纵坐标的最后的,荧光强度,会不同，同时有时候低浓度的荧光强度跑得会比高浓度的还高了。,扩增曲线、荧光阈值、Ct值,这几个概念搞清楚了，让我们来看看PCR定量原理的,公式：,定量原理,n：扩增反应的循环次数,X：第n次循环后的产物量,X,0,：初始模板量,（样本）,Ex：扩增效率,理想的PCR反应（Ex=1）：,X=X,0,*2,n,非理想的PCR反应：,X=X,0,(1+,Ex,),n,在扩增产物达到阈值线时:,M:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.,在阈值线设定以后,M是一个常数,M=X,0,(1+Ex),Ct,(1),方程式(1)两边同时取对数得:,lg M=lg X,0,(1+Ex),Ct,(2),整理方程式(2)得:,lg,X,0,=lg M-,Ct,lg(1+Ex),(3),Lg起始浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到,域值的循环数即,CT值,就可计算出样品中所含的模板量。,标准曲线,我们可以看到,模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。,Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,确定未知样品的 C(t)值,（,我们通过,阈,线能看到）,通过标准曲线由未知样品的,C(t)值推算出其初始量,绝对,定量,总结,通过PCR，监测实时荧光强度的技术，我们可以从CT值算出样本的浓度，这就是实时荧光定量,PCR,。有时候我们会碰到标准曲线跑得不好或出不来，我们可以参照以,前的,阈,值,阈,线,，然后通过CT值去自己手工测算样品的浓度，但是如果没有一定的经验不建议大家这样去做，标准曲线跑得不好的话，作为一名合格的检验者，我们首要的问题就是要找出原因，而不是急于把结果发出。,完,谢谢大家！,