岛津LC-10AT型HPLC操作规程2.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second Level,Third Level,Fourth Level,Fifth Level,*,第一节,岛津,LC-10AT,型,HPLC,操作规程,1,目的:,规范岛津,LC-10AT,型高效液相色谱仪的使用。,范围:,适用于岛津,LC-10AT,型高效液相色谱仪的使用。,职责:,操作,员对本规程的实施负责。,2,一、,系统组成,本系统由,1,个,LC-10ATvp,溶剂,输送泵,、,Rheodyne,7725i,手动,进样阀,、,SPD-10Avp,紫外-可见,检测器,、,N2000,色谱数据,工作站,和,电脑,等组成，另外还包括打印机。,3,二、,准备,1,、,准备所需的流动相，用合适的,0.45,m,滤膜,过滤，超声脱气20,min。,2,、,根据待检样品的需要更换合适的,色谱,柱（注意方向）和定量环。,3,、,配制样品和标准溶液，用合适的0.45,m,滤膜过滤。,（注意腐蚀性与有机系的的溶剂）,4,、,检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。,4,接通电源，依次开启不间断,电源,、,泵,、,检测器,，待泵和检测器自检结束后，打开打印机、电脑显示器、主机，最后打开色谱,工作站,。,三、,开机,5,四、,参数设定,1,、,波长设定,：,在检测器显示初始屏幕时，按,func,键,1次,，,波长,数字键,闪动，,输入所需波长值，按,Enter,键确认。按,CE,键退出到初始屏幕。,2,、,流速设定：,在泵显示初始屏幕时，按,func,键，用数字键输入所需的流速（流速一般,为,超过1,ml/min），,按,Enter,键确认。按,CE,键退出,6,五、,更换流动相并排气泡,1,：,将管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中；,2,：,逆时针转动泵的排液阀180，打开排液阀；,3,：,按泵的,purge,键，,pump,指示灯亮，泵大约以,9.9,ml/min,的,高,流速冲洗，3,min（,可设定）后自动停止,，一般视管路无气泡即可。,4,：,将排液阀顺时针旋转到底，关闭排液阀。,5,：,如管路中仍有气泡，则重复以上操作直至气泡排尽。,6,：,如按以上方法不能排尽气泡，从柱入口处拆下连接管，放入废液瓶中，设流速为5,ml/min，,按,pump,键，冲洗3,min,后再按,pump,键停泵，重新接上柱并将流速重设为规定值。,7,六、,平衡系统,1,、,查看基线,：,1.1,：,按,N2000,色谱数据工作站操作规程打开“在线色谱工作站”软件，,1.2,：,输入实验信息并设定各项方法参数后，,1.3,：,按下“数据收集”页的 按钮。,8,六、,平衡系统,2,、,2.1,：,按泵的,pump,键，泵启动，,pump,指示灯亮。用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需,6倍柱体积,的流动相。,2.2,：,检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。,2.3,：,观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应,不超过1,MPa,。,如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡，按,检查管路后再,操作。,2.4,：,观察基线变化。如果冲洗至基线漂移0.01,mV/min，,噪声为25,mmol,/L,的缓冲液,4.,每天冲洗柱,5.,稳定进样条件,调节流动相,6.,采用保护柱,38,二、,保留时间缩短,1.,流速增加,2.,样品超载,3.,键合相流失,4.,流动相组成变化,5.,温度增加,1.,检查泵,重新设定流速,2.,降低样品量,3.,流动相,PH,值保持在,37.5,检查柱的方向,4.,防止流动相蒸发或沉淀,5.,柱恒温,39,三、,保留时间延长,1.,流速下降,2.,硅胶柱上活性点变化,3.,键合相流失,4.,流动相组成变化,5.,温度降低,1.,管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡,2.,用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱,3.,流动相,PH,值保持在,37.5,检查柱的方向,4.,防止流动相蒸发或沉淀,5.,柱恒温,40,四,、,出现肩峰或分叉,1.,样品体积过大,2.,样品溶剂过强,3.,柱塌陷或形成短路通道,4.,柱内烧结不锈钢失效,5.,进样器损坏,1.,用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的,15%,2.,采用较弱的样品溶剂,3.,更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件,4.,更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品,5.,更换进样器转子,41,五、,鬼峰,1.,进样阀残余峰,2.,样品中未知物,3.,柱未平衡,4.,三氟乙酸,(,TFA),氧化,(,肽谱,),5.,水污染,(,反相,),1.,每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗,2.,处理样品,3.,重新平衡柱,用流动相作样品溶剂,(,尤其是离子对色谱,),4.,每天新配,用抗氧化剂,5.,通过变化平衡时间检查水质量，用,HPLC,级的水,42,六、基线噪声,1.,气泡,(,尖锐峰,),2.,污染,(,随机噪声,)3.,检测器灯连续噪声,4.,电干扰,(,偶然噪声,),5.,检测器中有气泡,1.,流动相脱气,加柱后背压,2.,清洗柱,净化样品,用,HPLC,级试剂,3.,更换氘灯,4.,采用稳压电源,检查干扰的来源,(,如水浴等,),5.,流动相脱气,加柱后背压,43,七、,峰拖尾,1.,柱超载,2.,峰干扰,3.,硅羟基作用,4.,柱内烧结不锈钢失效,5.,柱塌陷或形成短路通道,6.,死体积或柱外体积过大,7.,柱效下降,1.,降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相,2.,清洁样品,调整流动相,3.,加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相,PH,值,钝化样品,4.,更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品,5.,更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件,6.,连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管,7.,用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱,44,八、,峰展宽,1.,进样体积过大,2.,在进样阀中造成峰扩展,3.,数据系统采样速率太慢,4.,检测器时间常数过大,1.,用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的,15%,2.,进样前后排出气泡以降低扩散,3.,设定速率应是每峰大于,10,点,4.,设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的,10%,45,八、,峰展宽,5.,流动相粘度过高,6.,检测池体积过大,7.,保留时间过长,8.,柱外体积过大,9.,样品过载,5.,增加柱温,采用低粘度流动相,6.,用小体积池,卸下热交换器,7.,等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱,8.,将连接管径和连接管长度降至最小,9.,进小浓度小体积样品,46,谢 谢！,47,