实验五、叶绿体的分离与观察.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验六 叶绿体的分离与观察,叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。,实 验 目 的,1.,通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法。,2.,观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并了解荧光显微镜的使用方法。,实验原理,组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。,一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。,Low speed,High speed,Differential centrifugation,试剂与器械,1.,器材,:,普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。烧杯,2,个,250ml,量筒,1,个,滴管,20,支,10ml,刻度离心管,20,支,试管架,5,个，纱布若干，载片和盖片各,4,片。,2.,试剂,:0.35mol/L,氯化钠溶液，,0.01%,吖啶橙,(acridine orange),。,三,.,实验步骤,（一）叶绿体的分离与观察,1.,选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称,30,g,于,150,ml,0.35mol/L,NaCl,溶液中，装入组织捣碎机。,2.,利用组织捣碎机低速,(5000,r/min),匀桨,3-5,min,。,3.,将匀浆用,6,层纱布过滤于,500,ml,烧杯中。,4.,取滤液,4,ml,在,1000,r/min,下离心,2,min,，,弃去沉淀。,5.,将上清液在,3000,r/min,下离心,5,min,。,弃去上清液，沉淀即是叶绿体,(,混有部分细胞核,),。,6.,将沉淀用,0.35,mol/,LNaCl,溶液悬浮。,7.,取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。,（二）菠菜叶手切片观察 新鲜菠菜叶 刀片切出一斜面置于载玻片上 滴加,12d,氯化钠溶液 盖上盖片显微镜下观察,实 验 结 果,（,一）叶绿体的分离和观察,1.,普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。,2.,以,Olympus,荧光显微镜为例，在先用,B(bule),激发滤片、,B,双色镜和,O530(orange),阴断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。,3.,加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。,（二）菠菜叶手切片观察,1.,在普通光镜下可以看到三种细胞,(1),表皮细胞,:,为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞,;(2),保卫细胞,:为构成气孔的成对存在的肾形细胞；,(3),叶肉细胞,:,为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。,2.,在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱,气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。,3.,用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光,气孔仍为绿色。,3.,用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光,气孔仍为绿色。,作 业,1.,根据荧光观察结果，绘制菠菜叶气孔的结构模式图。,思考题：,1.,叶绿体分离的实验原理是什么？在分离叶绿体时应注意些什么问题？,五,.,实验结果,1,.,普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。,2.,用目微尺和台微尺测量一下叶绿体的长轴和短轴，分别测量,5-10,个叶绿体，求其平均值。,六,.,思考题,分别计算不同物镜放大倍数下测微尺的单位。,2.,鸭红细胞直径为多少微米,.,