第二章 抗原与抗体.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第二部分,B,细胞和,T,细胞应答的产生,B,细胞和,T,细胞应答的产生,抗原和抗体,补体系统,主要组织相容性复合物和抗原递呈,T,细胞,B,细胞,第二章 抗原和抗体,抗原和抗体,抗原的基本知识,抗体的基本知识,免疫球蛋白基因的组成与表达,抗原抗体相互作用,第一节 抗原的基本知识,抗原性与免疫原性,免疫原性,(immunogenicity),诱导,体液和,/,或细胞介导的,免疫反应的能力,抗原性,(antigenicity),与免疫反应最终产物,(,如抗体和,/,或,T,细胞表面受体,),特异结合的能力。,有免疫原性也有抗原性，但是反之并非这样。,抗原与半抗原,免疫原,(immunogen),具有免疫原性,半抗原,(hapten),仅具有抗原性,抗原,/,免疫原,(antigen/immunogen,在同一动物机体内是同意词,),，,能够诱导机体免疫反应并与相应抗体或,T,细胞受体发生特异反应的物质。,一个物质能否作为抗原，既取决于机体，也取决于抗原本身,免疫系统的抗原结合分子,抗体,(,免疫球蛋白，,Ig),T,细胞受体,(TCR),主要组织相容性复合体,(MHC),导致免疫原性的抗原特性,外源性,分子大小,MW.5000-10000,化学组成与复杂性,如异聚物比同聚物免疫原性更强,抗原加工和递呈的敏感性,如不可溶的大分子通常是比可溶性小分子免疫原性更强（不可溶的大分子易于吞噬和加工）；不能被降解递呈的大分子物质免疫原性很低。,外源性,(Foreignness),机体对“我,/,非我”,(self/nonself),的识别导致免疫反应,我,耐受,(,在淋巴细胞发育期间未成熟淋巴细胞与自身成分相接触,),非我,反应,(,抗原在这一关键时期没有与未成熟淋巴细胞,相接触,),免疫原与被免疫动物之间在系统发育上距离的远近，免疫原保守性的强弱，影响免疫原性的强弱。,导致免疫原性的生物系统,宿主的遗传组成,MHC,，,BCR,和,TCR,等基因严重影响免疫原性,抗原的免疫方式,免疫剂量、免疫途径与免疫次数,佐剂的使用,佐剂,(Adjuvants),定义：,当与抗原混合一起注射能增强抗原免疫原性的物质。,佐剂增强免疫原性的主要表现方式：,1,）延长抗原的存在,2,）增强辅刺激信号,3,）局部炎性增强,(,肉芽肿，,granuloma,，或其它炎性细胞反应,),4,）使被刺激的淋巴细胞非特异性增殖,费氏佐剂,(Freund,s adjuvants),1),不完全佐剂,(IFA):,石蜡油、羊毛脂等，可减少抗原用量到,1%,，延长抗体合成期,2),完全佐剂,(CFA):,在,IFA,中加入结核菌或该菌细胞壁，其作用在于增强宿主细胞介导的免疫应答及抗体合成,常用佐剂基本作用方式,抗原表位,(Epitopes),免疫细胞不识别或作用于完整的抗原分子，替代的淋巴细胞仅识别大分子中个别的位点，这些位点称为抗原表位,(Epitopes),或抗原决定簇,(Antigen determinants),淋巴细胞与复杂抗原的相互作用，可能发生在抗原结构的几个不同水平上。,B,、,T,淋巴细胞识别不同的抗原表位。,T,细胞与,B,细胞抗原识别的比较,B,细胞抗原表位的特性,天然蛋白的,B,细胞抗原表位通常由蛋白表面的亲水氨基酸组成，易于接近膜结合或自由的抗体。,顺序抗原表位Sequential Epitopes),连续抗原表位,(Continuous Epitopes),蛋白质一级结构,结构抗原表位,(Continuous Epitopes),不连续抗原表位,(Discontinuous Epitopes),，蛋白质三级结构,蛋白质结构与抗原表位,一级结构与顺序表位,二级结构与抗原反应性,三级结构与结构表位,四级结构与结构表位、免疫原价数,半抗原的免疫特性,半抗原仅具有抗原性（反应原性，特异性）,当与某种载体偶联后（半抗原载体结合物，,hapten-carrier conjugate,）能表现免疫原性,半抗原载体结合物的特异性存在三类抗原决定,1,）半抗原决定簇,2,）未受影响的载体蛋白表位,3,）半抗原和载体分子结合区形成的新表位,第二节 抗体的基本知识,抗体,(Antibody),抗体，是与特定抗原发生特异性结合的蛋白质,(,免疫球蛋白,Ig),B,细胞表面抗体识别免疫原，启动记忆,B,细胞和浆细胞的增殖和分化,浆细胞分泌具有抗原特异性的可溶性抗体分子,可溶性抗体分子与亲本,B,细胞表面受体具有相同的抗原识别性,抗体的基本结构与功能,共同的,4,肽链结构：两条相同的轻链,(L,22,000 Da),两条相同的重链,(H,55,000 Da),每条轻链和重链间通过二硫键和非共价键连接成异二聚体,(H-L),，两个相同的,H-L,再结合成,(H-L),2,的抗体基本结构,不同抗体间，轻链和重链最初的约,110aa,是改变很大的，称为可变,(Variable,V),区；其余部分则相当保守，称为固定,(Constant,C),区。,重链上连有糖链。,抗体的基本结构是与其功能（抗原结合；效应功能介导）相对应的,免疫球蛋白基本结构的发现,1940,年前后，,Tiselius&Kabat,发现抗体的活性存在于血清,-,球蛋白,R.Porter,，木瓜蛋白酶,(papain),消化,-,球蛋白中的,IgG,A.Nisonoff,，胃蛋白酶,(pepsin),消化,IgG,G.Edelman,2-,巯基乙醇（,mercaptoethanol,）还原Fab(fragment,antigen-binding);,Fc(fragment,crystallizable),150,，,000Da,50,，,000Da,45,，,000Da,100,，,000Da,50,，,000Da,22,，,000Da,多发性骨髓瘤与抗体氨基酸序列的研究,一个问题：,-,球蛋白中的抗体群是有许多不同抗体组成的，而,aa,序列分析需要纯蛋白,正常个体的浆细胞，末期细胞，仅在有限的时间分泌抗体。,多发性骨髓瘤（,multiple myeloma,）病人的骨髓瘤细胞（肿瘤浆细胞）能无限增殖，持续分泌特异性抗体。患者血清中,95%,的免疫球蛋白是这种骨髓瘤蛋白，其中许多病人的骨髓瘤细胞分泌超量的轻链蛋白。,Bence-Jones,首先在尿液中发现了这些超量的轻链蛋白，称为,Bence-Jones,蛋白。,Normal plasma cells help protect the body from germs and other harmful substances.,Myeloma cell(abnormal plasma cell)making M proteins.,轻链、重链分型与抗体分类,根据,C,区,aa,顺序（一级结构）,轻链：,(kappa),和,(lambda),重链,：,(,mu,),、,(gamma),、,(alpha),、,(delta),、,(epsilon),依据重链分型不同,Ig,分为,IgM,、,IgG,、,IgA,、,IgD,和,IgE5,类,免疫球蛋白的二级结构：反平行,片层和环状结构,(loops),免疫球蛋白的三级结构,免疫球蛋白的四级结构,可变区与抗原结合,不同特异性抗体可变区的氨基酸顺序比较显示，变异仅集中在其中一些独特的区域（占总氨基酸的,15-20%,），这些区域被称为超变区（,hypervariable regions,）,;,其余区域称为框架区（,framework regions,）,超变区是抗原结合位，与抗原表位互补，又称为互补决定区（,complement-determining regions,，,CDRs,）。,CDRs,位于环状结构。,固定区与抗体生物活性,C,L,和,C,H,1,：有助于提高抗原结合，升高,Fab,臂最大旋转性，参与抗体多样性,铰链区（,IgA,、,IgD,、,IgG,）,富含,Pro,和,Cys,，富有弹性，形成二硫键,IgE,、,IgM,的,C,H,2,区功能不确定,IgA,、,IgD,、,IgG,的,C,H,2,或,IgE,、,IgM,的,C,H,3,连接有糖基，因而亲水性较强，,IgM,、,IgG,通过此结构域激活补体，发生生物学效应。,抗体,Fc,片段上两结构域共同与细胞膜,Fc,受体结合，发挥不同的生物学效应。,分泌免疫球蛋白,(,sIg,),与膜结合免疫球蛋白,(,mIg,),Secreted immunoglobulin,（,sIg,）,Membrane-bound immunoglobulin,（,mIg,）,sIg,的重链羧末端结构域（,IgA,、,IgD,、,IgG,的,C,H,3,或,IgE,、,IgM,的,C,H,4,）在结构和功能上不同于,mIg,的相应结构域,sIg,:,亲水型,aa,组成,mIg,包括三段不同序列：,胞外亲水序列,疏水跨膜序列（,26aa,）,胞质部分,B,细胞不同发育阶段表达不同类型的,Ig,B,细胞不同发育阶段表达不同类型的,Ig,但表达不同类型,Ig,的同一细胞，其抗原特异性一致。,免疫球蛋白种类与功能多样性,免疫球蛋白的抗原决定,同种型（,Isotype,）,由,C,区决定,同种异型（,Allotype,）,由,C,区同一基因位置上不同等位基因的差异决定,独特型（,Idiotype,）,由可变区决定,Fc,受体识别抗体,Fc,区,抗体,B,细胞,Fc,受体,B,细胞、,T,细胞、,中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞,免疫球蛋白超家族,单克隆抗体,多克隆抗体：,抗原多个表位诱导多种,B,细胞克隆增生与分化，产生多种抗体的混合物,单克隆抗体：单个抗原表位诱导单种,B,细胞克隆增生与分化，产生单克隆抗体,单克隆抗体与细胞分化簇,(CD),细胞分化簇,(clusters of differentiation,CD),：白细胞表面的免疫功能分子，通过独特的单克隆抗体的识别，能够区分不同世系和阶段的免疫细胞,CD1-CD350,第三节,免疫球蛋白基因的组成与表达,基因表达的中心法则,B,细胞发育与免疫球蛋白基因表达,抗体的特征与其基因表达,与抗体特异性相应的巨大的抗体多样性,Ig,中存在着重链和轻链氨基端的可变区与羧基端的固定区,具有相同抗原特异性的同型抗体，是具有既定的可变区和不同的重链固定区,抗体多样性的产生,可变区基因的重排,固定区基因的种类替换,Ig,基因的表达、合成、装配和分泌,解释抗体结构多样性的遗传理论,胚系理论（,germ-line theories,），认为,胚胎细胞（卵和精子）基因组,含有大量的,Ig,基因，不存在导致抗体多样性的特殊遗传理论。,无法解释：,当固定区不变时，产生可变区多样性的进化机制,体细胞变异理论（,somatic-variation theories,），,基因组包含有,相对小数目的,Ig,基因，大量的抗体特异性产生于体细胞的变异或重组。,无法解释：,当产生可变区多样性时，保证固定区不变的机制,Dreyer&Bennett,的双基因模式,(,Two-Gene Model,，,1965,年,),两个分开的基因编码一条,Ig,的重链或轻链，一个基因编码可变区，另一个编码固定区；,这两个基因在,DNA,水平同步以保证转录和翻译为一条单独的重链或轻链；,在胚系中，存在着成百上千的可变区基因，而仅需要存在一个单独的固定区基因。,问题：当时没有直接的实验证据，而且与“一个基因编码一条多肽链”的生物学原则矛盾。,利根川进,(,Susnmu,Tonegawa,),理论：免疫球蛋白基因重排,1976,年提出，,1987,年获诺奖,V,区和,C,区基因呈分离状态，并在,B,细胞分化成熟过程中不断进行重排,目前的理论：免疫球蛋白基因的多基因组成,和,轻链以及重链由位于不同染色体上分开的多基因家族编码。,在胚系,DNA,中，每个多基因家族包含多个被非编码区分割的编码序列，称为基因片段（,gene segments),。,重链,轻链,轻链,小鼠免疫球蛋白胚系基因片段的组成,基因可变区重排：轻链,DNA,的,V-J,重排,基因可变区重排：重链,DNA,的,V-J,重排,基因可变区重排的机制：重组信号序列引导重组,重组信号序列,(recombin-ation signal sequences,RSS):,位于基因片段侧翼,(V,的,3,；,J,的,5,；,D,的两侧,),的小段,DNA,序列。,功能,:,作为重排基因的重组加工信号。,RSS,组成,:,保守的回文结构七聚体,+12,或,23bp,的间隔序列,+,保守的富含,AT,的九聚体,One-turn RSS:,含,12bp,间隔序列的,;Two-turn RSS:,含,23bp,间隔的序列。,它们总是相互连接，因此称为,one-turn/two-turn,连接规则或,12/23,规则。,基因可变区重排的机制：重组酶连接基因片段,V(D)J,重组酶,:,催化,RSSs,与编码序列间的连接反应,(V-(D)-J,重组,),。,RAG,(recombination-activating genes)-1,和,RAG-2,，仅在淋巴细胞特异表达。,删除连接与翻转连接,具体的一些步骤：,1),重组酶识别,RSSs,，两信号序列和邻近的编码序列靠近到一起,2)RAG-1,和,RAG-2,在信号序列和编码序列结合处单链切割,3)RAG-1,和,RAG-2,催化,DNA,的双链切割，同时在编码序列末端和信号序列双链切割的末端产生一个发夹结构,基因可变区重排的机制：重组酶连接基因片段,4,）单链内切核酸酶随机切割发夹结构产生回文的,P-,区核苷酸加入；,5,）末端脱氧核酸转移酶,(TdT),在重链,V,D,J,编码序列的切割末端加上至,15,个核苷酸的,N-,区核苷酸；,双链断裂修补酶（,DSBR,）修补和连接组合编码序列和信号序列，产生编码连接序列和信号连接序列,基因可变区重排的机制：连接弹性,(,连接多样性,),连接弹性（,junctional flexibility,）,又称连接多样性（,junctional diversity,），即在V-(D)-J,重排中，信号序列与编码序列的链接是精确的，而随后的编码序列间的连接是不精确的。,连接弹性的结果导致了重排的多样性，也导致某些重排是没有结果的。,基因可变区重排的机制：等位基因排斥确保了单抗原特异性,等位基因排斥（,allelic exclusion,），在一个,B,细胞中，虽然,B,细胞是二倍体，但是仅表达来自一条染色体的重链重排基因或轻链重排基因。,确保了功能,B,细胞从不表达多于一个的,V,H,D,H,J,H,或,V,L,J,L,这一现象提示一旦一个,V,H,D,H,J,H,或,V,L,J,L,重排物产生，重组的机制就关闭了,等位基因排斥的模型，首先重链基因重排，一旦一个重链基因重排发生，其蛋白产物就阻止别的重链等位基因重排事件,而启动轻链基因重排,。,抗体多样性的产生,多胚系基因片段：,Multiple germ-line gene segments,V-(D)-J,连接组合：,Combinatorial V-(D)-J joining,连接弹性：,Junctional flexibility,P-,区核苷酸增加：,P-region nucleotide addition(P-addition),N-,区核苷酸增加：,N-region nucleotide addition(N-addition),体细胞高突变：,Somatic hypermutation,轻重链组合：,Combinatorial association of light and heavy chains,多胚系基因片段与,V-(D)-J,连接组合,连接弹性,:,信号序列精确连接，编码序列连接不精确,P,核苷酸增加和,N-,核苷酸增加中的随机性,B,细胞发生随机的高频率体细胞突变,固定区基因间的种类转换,(class switching),种类转换,:B,细胞抗原刺激后，重链,DNA,进行进一步的重排，,V,H,D,H,J,H,能与任何,C,H,基因片段结合。这一过程称为种类转换或同型转换，其参与的,DNA,侧翼序列,(,转换区,，,switch regions),位于每个,C,H,片段的上游。,转换信号来自于细胞因子。,IL-4,诱导的种类转换机制,Ig,基因表达（,mIg,or,sIg,）,Ig,基因表达,(,同时表达,IgM,和,IgD,）,免疫球蛋白的合成、装配和分泌,免疫球蛋白基因的转录调控,第四节,抗原,-,抗体相互作用,主要内容,抗原抗体反应的原理,交叉反应,(Cross Reactivity),沉淀反应和凝集反应,抗原抗体反应的应用,放免测定、,Elisa,、,Western Blot,抗原抗体反应的原理,抗原抗体之间的相互作用力：,氢键,离子键,疏水作用力,范德华力,亲和力可以用来衡量抗原抗体的结合能力,抗原抗体反应的化学平衡,平衡常数,平衡常数又称为,亲和力常数,(affinity constant),解离常数,平衡透析法确定亲和力常数,抗体与单价抗原的作用,r,：表示结合的抗原浓度与总抗体浓度的比率,c,：表示游离的抗原浓度,n,：表示抗体的价数,亲和力的测定,Polyclonal antibody,抗体与多价抗原的作用,亲合力（,avidity,）,一个抗体与整个抗原的结合能力。,亲合力大大强于每一位点的亲和力，其强度增加不仅仅是亲和力的简单相加，而是呈几何级数上升的。,交叉反应,交叉反应是指不同抗原分子上有相同或相似的,抗原决定簇,一种抗体可以与两种或两种以上的抗原发生反应。,沉淀反应,可溶性抗原与抗体结合，在两者比例合适时，可形成较大的不溶性免疫复合物。在反应体系中出现不透明的沉淀物，这种抗原抗体反应称为,沉淀反应,(precipitation reaction),。,凝胶中的沉淀反应,电泳条件下的沉淀反应,凝集反应,颗粒性抗原,(,如细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒,),与相应抗体结合，在一定条件下可形成凝集团块的现现象称为,凝集反应,(agglutination reaction),。,放射免疫测定,(Radioimmunoassay,RIA),酶联免疫吸附测定,(ELISA),Western Blotting,免疫沉淀,(,immunoprecipitates,),磁珠分选,免疫荧光,(,immunofluorescence,),荧光与流式细胞术,(Flow,Cytometry,),免疫胶体金与电子显微镜,